一種細(xì)胞分選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種細(xì)胞分選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著細(xì)胞替代治療的發(fā)展，干細(xì)胞移植治療已成為臨床上治療某些疾病的重要手段，利用干細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)并誘導(dǎo)成所需要的細(xì)胞后移植入患者體內(nèi)，用于組織損傷的修復(fù)、退行性器官的替代及改善遺傳性缺陷組織器官的功能。而成體干細(xì)胞可塑性分化的發(fā)現(xiàn)，為細(xì)胞替代治療提供了新的方向。盡管在細(xì)胞治療領(lǐng)域已取得一些列進(jìn)展，但仍存在重大挑戰(zhàn)。要達(dá)到治療疾病的目的就必須要獲得治療目標(biāo)疾病所需的精確細(xì)胞群，一旦進(jìn)行移植，要確保這些細(xì)胞達(dá)到需要它們的位點(diǎn)，整合到現(xiàn)有組織中。細(xì)胞純度是細(xì)胞治療面臨的技術(shù)問(wèn)題之一。
[0003]細(xì)胞分離(cell isolat1n)，指的是將組織分散制成細(xì)胞懸液后從中獲取目的細(xì)胞的過(guò)程。而所謂細(xì)胞純化更進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)從原代培養(yǎng)成分混雜的異質(zhì)性細(xì)胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類(lèi)型細(xì)胞的過(guò)程。通過(guò)細(xì)胞的分離和純化過(guò)程，是培養(yǎng)物成為單一類(lèi)型培養(yǎng)物，甚至是遺傳特性完全一致的培養(yǎng)物，后者即細(xì)胞系。分離和純化兩個(gè)概念之間沒(méi)有截然的界限，許多情況下，細(xì)胞分離和純化并不是完全徹底的，培養(yǎng)物種只能達(dá)到以某種細(xì)胞為主的程度，所以也稱(chēng)為富集(enrichment)。分離和純化細(xì)胞的過(guò)程不僅僅在原代培養(yǎng)之前進(jìn)行的，有時(shí)分離和純化細(xì)胞的過(guò)程還貫穿于原代培養(yǎng)之和繼代培養(yǎng)的過(guò)程中，甚至是主要依賴(lài)培養(yǎng)過(guò)程實(shí)現(xiàn)分離和純化細(xì)胞的目的。培養(yǎng)物種細(xì)胞成分是否單一或者目的細(xì)胞在培養(yǎng)物中的比例如何，常是衡量某一培養(yǎng)工作是否成功的重要指標(biāo)。細(xì)胞的分離純化包括密度梯度離心技術(shù)、逆流淘析分離技術(shù)、利用細(xì)胞表面標(biāo)志分離純化細(xì)胞的方法等，其中前兩種方法并沒(méi)有使目的細(xì)胞群相對(duì)于有核細(xì)胞發(fā)生太多的富集。細(xì)胞的可逆分選是指能夠?qū)⒓?xì)胞從分選載體上釋放出來(lái)的細(xì)胞分選方法，近年來(lái)，雖然已有利用適配體和溫敏聚合物來(lái)可逆分選癌細(xì)胞的報(bào)道，但關(guān)于干細(xì)胞的可逆分選仍屬空白。
[0004]細(xì)胞治療在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育及器官組織修復(fù)過(guò)程中已表現(xiàn)出巨大的潛力，在臨床應(yīng)用上前景也十分廣闊，因此解決細(xì)胞純度問(wèn)題將有助于細(xì)胞治療的臨床發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出一種細(xì)胞分選方法，利用生物素與脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素的原理，將細(xì)胞與標(biāo)有脫硫生物素的特異抗體和標(biāo)有鏈霉親和素的磁珠進(jìn)行孵育，最終通過(guò)生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素和磁性富集獲得目的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)后獲得數(shù)量和純度均達(dá)到移植要求的細(xì)胞。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種細(xì)胞分選方法，包括:與細(xì)胞表面抗原特異結(jié)合的抗體，功能性磁珠，所述抗體為脫硫生物素標(biāo)記的抗體，所述功能性磁珠為標(biāo)記了鏈霉親和素的磁珠，利用生物素與脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素，以及細(xì)胞表面標(biāo)志，進(jìn)行細(xì)胞的分選。
[0007]優(yōu)選的，包括以下步驟:
A、所述抗體進(jìn)行脫硫生物素標(biāo)記；
B、標(biāo)記后的所述抗體與細(xì)胞孵育；
C、經(jīng)過(guò)步驟B處理后的細(xì)胞與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠進(jìn)行孵育；
D、生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠；
E、去除所述磁珠，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理。
[0008]優(yōu)選的，步驟A中，包括:將所述抗體與適量活化的脫硫生物素混合，室溫孵育，孵育時(shí)間為20-40min，以30min為宜。
[0009]為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的效果，采用超濾管對(duì)步驟A中得到的混合液進(jìn)行清洗，除去多余的脫硫生物素。
[0010]優(yōu)選的，步驟B中，包括:消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液為I X 105-2 X 105/ml的濃度，所述抗體與細(xì)胞懸液以1:(50-150)的體積比，優(yōu)選1:100的體積比室溫孵育后，用PBS
將細(xì)胞清洗三次。
[0011]優(yōu)選的，步驟C中，包括:將步驟B中獲得的細(xì)胞沉淀重懸于80-120U1，優(yōu)選10ul預(yù)冷的PBS+BSA緩沖液中，鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠與緩沖液以1: (10-50)的體積比，優(yōu)選1:25的體積比室溫孵育，所述磁性富集后用PBS清洗三次。
[0012]優(yōu)選的，步驟D中，包括:配置生物素溶液8-15um，優(yōu)選10um，并調(diào)整為PH7，將步驟C中磁性富集得到的細(xì)胞與所述磁珠組成的復(fù)合物沉淀重懸于150-250ul，優(yōu)選200ul生物素溶液中，室溫孵育I小時(shí)。
[0013]優(yōu)選的，所述磁珠的直徑為lum。
[0014]本發(fā)明的所述細(xì)胞分選方法，利用生物素與脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素的原理，將細(xì)胞與標(biāo)有脫硫生物素的特異抗體和標(biāo)有鏈霉親和素的磁珠進(jìn)行孵育，最終通過(guò)生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素和磁性富集獲得目的細(xì)胞。經(jīng)過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)后獲得數(shù)量和純度均達(dá)到移植要求的細(xì)胞，相比于其他技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì):
I)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，所用儀器設(shè)備均為實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的基本設(shè)備，如離心機(jī)、搖床、核酸分離磁架，不需要復(fù)雜儀器。
[0015]2)本發(fā)明所用抗體均為普通抗體，不需要熒光標(biāo)記，成本低。
[0016]3)本發(fā)明最終能夠?qū)⒓?xì)胞從磁珠上釋放，獲得的目的細(xì)胞不含磁珠，更適用于臨床。
[0017]4)本發(fā)明能夠在較短時(shí)間內(nèi)通過(guò)簡(jiǎn)單操作獲得目的細(xì)胞，減少了細(xì)胞的污染幾率。
[0018]5)所述細(xì)胞分選方法過(guò)程可逆，既能將細(xì)胞結(jié)合到所述磁珠上，又能將其釋放。
[0019]6)所述細(xì)胞分選方法中，不需要流式分選儀就能將目的細(xì)胞與非目的細(xì)胞分開(kāi)，只需要普通的核酸提取磁架即可將目的細(xì)胞與非目的細(xì)胞分開(kāi)。
【附圖說(shuō)明】
[0020]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0021]圖1為本發(fā)明一種細(xì)胞分選方法原理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例
[0023]1、脫硫生物素標(biāo)記抗體
將待脫硫生物素化的CD105抗體用0.1 mo I/L碳酸氫鈉緩沖液稀釋到I mg/ml ；NHS-脫硫生物素用DMSO溶解，配制成1mM的溶液，按照如下公式計(jì)算出標(biāo)記抗體所需NHS-脫硫生物素的量:
所需脫硫生物素的量=抗體的體積X抗體的濃度/抗體的摩爾質(zhì)量X需要標(biāo)記的脫硫生物素倍數(shù)
按照計(jì)算出來(lái)的量將抗體與NHS-脫硫生物素混合，室溫孵育30min后用30KD的超濾管將多余的脫硫生物素去除。
[0024]
2、細(xì)胞與抗體孵育
將間充質(zhì)干細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞分別用胰酶消化后計(jì)數(shù)，1:1比例混合兩種細(xì)胞調(diào)整濃度為lX 105-2X 105/ml，然后實(shí)驗(yàn)組按照⑶105抗體與細(xì)胞懸液以1:100的體積比室溫孵育20min，對(duì)照組不加抗體同樣在室溫孵育20min，孵育結(jié)束后用PBS將細(xì)胞洗三次。
[0025]
3、抗體-細(xì)胞與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠孵育
將步驟2中獲得的細(xì)胞沉淀重懸于100 μ I預(yù)冷的PBS+1% BSA緩沖液中，鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠與緩沖液以1:25的體積比室溫孵育I小時(shí)，磁性富集后用PBS清洗三次。
[0026]
4、生物素與脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素
配置濃度為10 μ M的生物素溶液，調(diào)整為ΡΗ7。將步驟3中磁性富集得到的細(xì)胞-磁珠復(fù)合物沉淀重懸于200 μ I生物素溶液中，室溫孵育I小時(shí)后磁性富集除去磁珠，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。
[0027]根據(jù)上述步驟，最終得到的細(xì)胞不含Α549細(xì)胞，只含有間充質(zhì)干細(xì)胞，且經(jīng)后續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)無(wú)異常。
[0028]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種細(xì)胞分選方法，其特征在于，包括:與細(xì)胞表面抗原特異結(jié)合的抗體，功能性磁珠，所述抗體為脫硫生物素標(biāo)記的抗體，所述功能性磁珠為標(biāo)記了鏈霉親和素的磁珠，利用生物素與脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素，以及細(xì)胞表面標(biāo)志，進(jìn)行細(xì)胞的分選。2.如權(quán)利要求1中所述細(xì)胞分選方法，其特征在于:包括以下步驟: A、所述抗體進(jìn)行脫硫生物素標(biāo)記； B、標(biāo)記后的所述抗體與細(xì)胞孵育； C、經(jīng)過(guò)步驟B處理后的細(xì)胞與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠進(jìn)行孵育； D、生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠； E、去除所述磁珠，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理。3.如權(quán)利要求2中所述細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟A中，包括:將所述抗體與適量活化的脫硫生物素混合，室溫孵育。4.如權(quán)利要求3中所述細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟A中，包括:用超濾管對(duì)得到的混合液進(jìn)行清洗，除去多余的脫硫生物素。5.如權(quán)利要求2中所述細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟B中，包括:消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液為lX 105-2X 105/ml的濃度，所述抗體與細(xì)胞懸液以1:(50-150)的體積比室溫孵育后，用PBS將細(xì)胞清洗。6.如權(quán)利要求2中所述細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟C中，包括:將步驟B中獲得的細(xì)胞沉淀重懸于預(yù)冷的PBS+BSA緩沖液中，鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠與緩沖液以1:(10-50)的體積比室溫孵育，所述磁性富集后用PBS清洗。7.如權(quán)利要求2中所述細(xì)胞分選方法，其特征在于:步驟D中，包括:配置生物素溶液，將步驟C中磁性富集得到的細(xì)胞與所述磁珠組成的復(fù)合物沉淀重懸于生物素溶液中，室溫孵育。8.如權(quán)利要求1-7中任一所述細(xì)胞分選方法，其特征在于:所述磁珠的直徑為lum。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提出了一種本發(fā)明的目的是利用生物素與脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素的原理，將含有特異細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)胞利用免疫磁珠進(jìn)行分選，最終得到目的細(xì)胞，本發(fā)明的過(guò)程包括抗體標(biāo)記脫硫生物素、抗體與細(xì)胞的孵育、細(xì)胞與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠的孵育、生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠四大步驟。本發(fā)明將免疫磁珠技術(shù)與生物素/脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素相結(jié)合，使得磁珠分選的優(yōu)點(diǎn)得以發(fā)揮，細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)過(guò)程更簡(jiǎn)單、得到的細(xì)胞質(zhì)量更高。
【IPC分類(lèi)】C12N5/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105018411
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510493571
【發(fā)明人】曾令文, 林姣, 王斗
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年8月12日