菌絲霉素蛋白的表達(dá)方法及其在抑痤瘡丙酸桿菌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及菌絲霉素蛋白的表達(dá)方法及其在抑痤瘡丙酸桿菌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]痤瘡是毛囊皮脂腺單位的一種慢性炎癥性皮膚病，是皮膚科最常見(jiàn)的疾病之一，其發(fā)病主要與性激素水平、痤瘡丙酸桿菌增殖、皮脂腺大量分泌，毛囊皮脂腺導(dǎo)管的角化異常及炎癥等因素相關(guān)。好發(fā)于青春期，有80%?90%的青少年患過(guò)痤瘡。雖然痤瘡是有自愈傾向的疾病，但是痤瘡本身以及痤瘡治療不及時(shí)引起的瘢痕可以嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，造成患者的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，需引起關(guān)注。痤瘡好發(fā)于面頰、額部、頰部和鼻唇溝，其次是胸部、背部和肩部。目前缺乏有效的痤瘡治療方法，往往很難收到良好的效果。
[0003]抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，多具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性及廣譜抗菌等特點(diǎn)。迄今為止，研究者已經(jīng)從細(xì)菌、真菌、兩棲類、昆蟲(chóng)、植物、哺乳動(dòng)物乃至人體中發(fā)現(xiàn)并分離獲得了具有抗菌活性的多肽。由于這些多肽對(duì)細(xì)菌具有廣譜高效殺菌活性，因而命名為“antibacterial peptides, ABP”。并隨著研究工作的深入，發(fā)現(xiàn)某些抗細(xì)菌肽對(duì)部分真菌、原蟲(chóng)、病毒及癌細(xì)胞等均具有殺傷作用。
[0004]Plectasin也稱為菌絲霉素，是2005年首次由Hans-Henrik Kristensen課題組從叫做腐生子囊菌假黑盤(pán)菌(Pseudoplectania nigrella)的一種真菌中分離得到。體外抑菌試驗(yàn)表明，Plectasin對(duì)于多種細(xì)菌具有很高的殺菌活性。進(jìn)一步體內(nèi)抑菌試驗(yàn)表明，在肺炎鏈球菌感染小鼠引起的腹膜炎和肺炎模型中，Plectasin的療效分別與萬(wàn)古霉素和青霉素相當(dāng)。此外，Plectasin具有選擇性殺滅作用，安全性高。Plectasin與細(xì)菌細(xì)胞壁形成的前體物質(zhì)Lipid II具有很強(qiáng)的親和性，可以通過(guò)與Lipid II結(jié)合阻止病菌細(xì)胞壁的形成，從而阻止病菌繁殖。Plectasin獨(dú)特的作用機(jī)制不易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性菌株。
[0005]雖然現(xiàn)有信息中的公開(kāi)了 Plectasin可以抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，但其是否能夠抑制痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)，是否可以用于痤瘡的治療，仍為未知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供菌絲霉素蛋白在抑制痤瘡丙酸桿菌中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種菌絲霉素蛋白的表達(dá)方法，包括以下步驟:
1)根據(jù)菌絲霉素NZ2114的蛋白序列SEQID NO: 1，合成優(yōu)化的編碼菌絲霉素NZ2114蛋白的基因序列SEQ ID NO:2 ;將所得的菌絲霉素基因序列SEQ ID N0:2連接到酵母表達(dá)載體PPicZa的a -factor信號(hào)肽下游的多克隆位點(diǎn)，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GSl 15中，篩選出陽(yáng)性重組菌；
2)將上步篩選出的陽(yáng)性重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)，提取并純化所表達(dá)的目的蛋白，即為菌絲霉素蛋白。
[0008]菌絲霉素蛋白在制備抑痤瘡丙酸桿菌藥劑中的應(yīng)用。
[0009]菌絲霉素蛋白在制備治療痤瘡藥劑中的應(yīng)用。
[0010]進(jìn)一步的，上述痤瘡為由痤瘡丙酸桿菌引發(fā)的痤瘡。
[0011]—種治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑，該菌絲霉素凝膠劑由以下質(zhì)量百分比的成分組成:菌絲霉素0.001%?0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量為水
一種治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑的制備方法，包括以下操作步驟:
1)將菌絲霉素蛋白用蒸餾水溶解備用；
2)尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油加入到蒸餾水中，加熱溶解完全，然后加入卡波姆940，使其充分溶脹，攪拌均勻，加入三乙醇胺，調(diào)節(jié)pH值至5.8?6.2，最后加入菌絲霉素蛋白溶液，攪拌均勻，即可獲得治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑；
上述所制得的菌絲霉素凝膠劑中含有以下質(zhì)量百分比的成分:菌絲霉素0.001%?0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯
0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量為水。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)菌絲霉素具有抑制痤瘡丙酸桿菌的作用，可用于制備痤瘡丙酸桿菌的抑菌劑；可進(jìn)一步用于治療痤瘡等皮膚炎癥，尤其是對(duì)目前難以治療的由痤瘡丙酸桿菌引發(fā)的痤瘡等皮膚炎癥具有良好的療效。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為菌絲霉素蛋白的RP-HPLC分析圖；
圖2為純化后的菌絲霉素蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)圖；
圖3為菌絲霉素蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌26003的抑制情況；I為20 μ L的I μ g/uL菌絲霉素蛋白；2為40 yL的I μ g/ μ L菌絲霉素蛋白；3為60 yL的的I μ g/ μ L菌絲霉素蛋白；4為80 μ L的的I μ g/ μ L菌絲霉素蛋白；5、為100 μ L的的I μ g/ μ L菌絲霉素蛋白；“6”為無(wú)菌水，作為陰性對(duì)照；“7”為氨芐青霉素Amp，作為陽(yáng)性對(duì)照；
圖4為菌絲霉素蛋白對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑制情況；1為20 μ L的I μ g/uL菌絲霉素蛋白；2為40 yL的I μ g/ μ L菌絲霉素蛋白；3為60 yL的的I μ g/ μ L菌絲霉素蛋白；4為80 μ L的的I μ g/μ L菌絲霉素蛋白；5、為10yL的的I μ g/μ L菌絲霉素蛋白；“6”為無(wú)菌水，作為陰性對(duì)照；“7”為氨芐青霉素Amp，作為陽(yáng)性對(duì)照；
圖5為本發(fā)明菌絲霉素凝膠劑治療面部痤瘡前后的對(duì)比圖；A、B分別為痤瘡患者正面治療前后對(duì)比圖；C、D為左側(cè)面治療前后的對(duì)比圖；E、F為右側(cè)面治療前后的對(duì)比圖；其中B、D、F為紅色區(qū)圖片，以觀察皮下毛細(xì)血管分布情況；
圖6為本發(fā)明菌絲霉素凝膠劑治療面部痤瘡前后的對(duì)比圖；A、B分別為痤瘡患者正面治療前后對(duì)比圖；C、D為左側(cè)面治療前后的對(duì)比圖；E、F為右側(cè)面治療前后的對(duì)比圖；其中B、D、F為紅色區(qū)圖片，以觀察皮下毛細(xì)血管分布情況。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0015]實(shí)施例1菌絲霉素蛋白的表達(dá) I)重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組菌的篩選
根據(jù)腐生子囊菌假黑盤(pán)菌中NZ2114菌絲霉素的蛋白序列SEQ ID N0:1，合成優(yōu)化的編碼菌絲霉素 NZ2114 的基因序列 CTCGAGAAAAGAGGITTCGGTTGTAACGGAC CTTGGAACGAAGATGATCTGAGGTGCCATAATCACTGTAAGTCAATCAAGGGATATAAGGGAGGTTACTGTGCCAAAGGTGGATTTGTTTGCAAATGCTACTAATAAGGATCCTAGGCSEQ ID NO: 2)。將所得的菌絲霉素基因序列(SEQ ID NO: 2)連接至IjpUC載體上，再雙酶切連入酵母表達(dá)載體pPicZ α的a-factor信號(hào)肽下游，利用Zeocin(博來(lái)霉素)作為抗性標(biāo)記進(jìn)行重組子篩選；然后將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行融合分泌表達(dá)，重組畢赤酵母菌能在甲醇誘導(dǎo)下高效持續(xù)的表達(dá)。其中的陽(yáng)性重組酵母菌的篩選為，先通過(guò)Zeocin (博來(lái)霉素)篩選出陽(yáng)性重組子，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確，將陽(yáng)性重組子進(jìn)行目的蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析篩選出高效表達(dá)菌絲霉素的重組酵母菌。
[0016]2)菌絲霉素蛋白的表達(dá)和純化
將篩選得到的能高效表達(dá)菌絲霉素的陽(yáng)性重組酵母菌轉(zhuǎn)接至BNGY培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24小時(shí)后，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，30°C繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)加入2%甲醇誘導(dǎo)，搖瓶培養(yǎng)72小時(shí)后，將培養(yǎng)基12000rpm/min離心30分鐘后，取上清，棄沉淀；上清經(jīng)飽和度為45?55%的過(guò)硫酸銨在4°C沉淀完全，12000rpm/min離心