牧草盲蝽ss-coi pcr快速檢測特異引物、檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及牧草盲蝽PCR檢測方法，具體涉及一種用于牧 草盲蝽SS-COI PCR快速檢測的特異引物、基于該引物的PCR快速檢測方法、試劑盒。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 牧草盲蝽（Lygus pratenszs (Linnaeus))，屬半翅目，盲蝽科。俗稱小臭蟲。主要 寄主為棉花、苜蓿、蔬菜、果樹、麻類等。分布在我國東北、華北、西北。為害棉花、甜菜、菠菜、 苜蓿、白菜、蘿卜、油菜、胡蘿卜等20余種作物以及雜草。
[0003] 我國北方1年生3-4代，以成蟲在雜草、枯枝落葉、土石塊下越冬。翌春寄主發(fā)芽 后出蟄活動，喜歡在嫩葉、嫩莖、花蕾上刺吸汁液，取食一段時間后開始交尾、產(chǎn)卵，卵多產(chǎn) 在嫩莖、葉柄、葉脈或芽內(nèi)，卵期約10天。若蟲共5齡，經(jīng)30多天羽化為成蟲。成、若蟲喜 白天活動，早、晚取食最盛，活動迅速，善于隱避。發(fā)生期不整齊，6月常迀入棉田，秋季又迀 回到木本植物或秋菜上。天敵主要有卵寄生蜂、捕食性蜘蛛、姬獵蝽、花蝽等。
[0004] 牧草盲蝽以成、若蟲危害，均以刺吸式口器刺傷植物組織，吸食汁液。棉苗生長點 被刺傷后，變黑而干枯，造成棉苗無頭或多頭；嫩葉受害后，初現(xiàn)黑褐色小點，后變黃枯萎， 展葉后出現(xiàn)穿孔、破裂或皺縮變黃。棉花幼蕾受害后變黑干枯，僵硬而脫落，俗稱"蕎麥粒"； 棉鈴受害后，出現(xiàn)黑色凹陷水漬斑，纖維變黃，出現(xiàn)僵瓣。
[0005] 牧草盲蝽在新疆南北部均有分布，以庫爾勒、阿克蘇、巴楚、麥蓋提等地發(fā)生較重， 嚴(yán)重影響棉花生長，是新疆棉區(qū)中的主要害蟲之一。
[0006] 捕食性天敵對害蟲具有捕食作用，可有效利用天敵對害蟲進(jìn)行生物防治。而研究 天敵對害蟲捕食作用的方法很多，主要采用田間直接觀察，消化道解剖觀察、以及酶聯(lián)免疫 法（ELISA)、同功酶電泳、蛋白質(zhì)電泳分析等，但這些方法都有耗時長、操作復(fù)雜、費用高等 局限性。目前，國內(nèi)外利用節(jié)肢動物食物網(wǎng)技術(shù)研究農(nóng)田害蟲和天敵的食物鏈關(guān)系，確定已 知的天敵，發(fā)現(xiàn)潛在的天敵，定量分析天敵對害蟲的捕食作用，對農(nóng)田害蟲的生物防治具 有積極意義。
[0007] Species-Specific-COI PCR檢測技術(shù)是在mtDNACOI技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特 異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用物種特異性COI引物（SS-COI)，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來鑒 定檢測樣本，無需測序和序列比對，其具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、快速、簡便等優(yōu) 點。為研究天敵對害蟲捕食作用提供了定性與定量分析的檢測方法。目前該方法已經(jīng)在棉 蚜等部分害蟲的研究中得到應(yīng)用。
[0008] 但牧草盲蝽的相關(guān)研究開展較少，在Genbank上尚未檢索到牧草盲蝽COI基因片 段，也未有關(guān)于基于特異性引物SS-COI檢測方法所必需的PCR擴(kuò)增特異引物的報道，因此 該方法尚未在牧草盲蝽的快速檢測方面得以應(yīng)用。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種基于特異性SS-COI引物的牧草盲蝽PCR快速檢測的所 需的特異引物、檢測方法及試劑盒。
[0010] 第一，本發(fā)明根據(jù)牧草盲蝽的線粒體DNA序列，設(shè)計一對牧草盲蝽的特異性 SS-COI引物，其包括：
[0011] 正向引物 LP84-5F : 5' -GGAGCAGGGACCGGATGAAC-3 '
[0012] 反向引物 LP84-5R : 5 ' -AAAGTAATAATAATGCGGTG-3 '。
[0013] 第二，本發(fā)明還提供含有引物L(fēng)P84-5F和LP84-5R的用于檢測牧草盲蝽的試劑盒， 該試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0014] 第三，本發(fā)明還提供一種基于特異性SS-COI引物的牧草盲蝽快速PCR檢測方法， 包括以下步驟：
[0015] (1)提取樣品DNA
[0016] 在田間采集牧草盲蝽，放入離心管中將其磨碎，用試劑盒提取單頭盲蝽基因組總 DNA，將DNA溶液保存于-20°C備用；
[0017] ⑵合成引物
[0018] 合成上述特異性SS-COI引物L(fēng)P84-5F和LP84-5R。
[0019] (3) PCR 擴(kuò)增
[0020] 以步驟⑴提取的DNA為模板，利用上述引物L(fēng)P84-5F和LP84-5R進(jìn)行PCR擴(kuò)增 反應(yīng)；PCR反應(yīng)體系以20 μ L計為：
[0021]
[0022] PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)熱3分鐘；之后94°C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 1分鐘，共45 個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
[0023] (4)分析PCR產(chǎn)物
[0024] 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像系統(tǒng) 中，如出現(xiàn)大小為220bp的DNA條帶（SEQ ID No. 3)，則表明樣品為牧草盲蝽。
[0025] 本發(fā)明是通過DNA條形碼技術(shù)中的通用引物
[0026] L印Fl : (5' -ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3'）和
[0027] L印Rl : (5 ' -AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3'）擴(kuò)增出牧草盲蝽的 COI 產(chǎn)物，與 綠盲蝽、苜蓿盲蝽和黑食蚜盲蝽等昆蟲的序列進(jìn)行比對，設(shè)計一對特異引物，該引物特異性 強，只針對牧草盲蝽擴(kuò)增出清晰、單一的長度為220bp的特異性條帶，而對棉田中的其它昆 蟲無擴(kuò)增效果。采用SS-COI PCR技術(shù)檢測牧草盲蝽，該技術(shù)操作簡單、快速，可在3個小時 內(nèi)完成檢測，且具有較高的靈敏度，DNA最低檢出濃度為0. 175ng/μ L。該引物及其檢測方 法和試劑盒用于植保領(lǐng)域牧草盲蝽優(yōu)勢天敵確定及食物鏈分析，特異性強，準(zhǔn)確率高，方便 快捷。 四、
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例中牧草盲蝽的特異性引物L(fēng)P84-5F/LP84-5R的PCR檢測結(jié) 果；其中，M :100bp DNA ladder ;1-70為表1中序號所對應(yīng)昆蟲的擴(kuò)增結(jié)果，-為陰性對照。
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例中牧草盲蝽的特異性引物L(fēng)P84-5F/LP84-5R的DNA濃度梯度 檢測結(jié)果；其中，M:100bp DNA ladder ;1-6為牧草盲蝽的DNA原模板濃度548ng/yL依次 5倍稀釋濃度梯度，7為陰性對照。 五、
【具體實施方式】
[0030] 以下實例均按照常規(guī)分子生物學(xué)實驗條件，以及按照產(chǎn)品說明書建議的條件進(jìn)行 操作。
[0031] 第一部分，引物L(fēng)P84-5F/LP84-5R對牧草盲蝽的擴(kuò)增
[0032] (1)牧草盲蝽基因組的制備
[0033] 在棉田采集牧草盲蝽，將單頭牧草盲蝽放入I. 5mL離心管中將其磨碎，用OMEGA Insect Genomic DNA Kit提取試劑盒（OMEGA公司，美國）提取單頭盲蝽基因組的總DNA。 將DNA溶液保存于-20°C備用，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時吸取1 μ L溶液作為DNA模板。
[0034] (2)合成檢測牧草盲蝽的特異性SS-COI引物
[0035] 特異性SS-COI引物序列如下：
[0036] LP84-5F :5' -GGAGCAGGGACCGGATGAAC-3'（SEQ ID No. 1)
[0037] LP84-5R :5，-AAAGTAATAATAATGCGGTG-3'（SEQ ID No. 2)
[0038] (3) PCR 擴(kuò)增
[0039] PCR反應(yīng)體系以20 μ L計為：
[0040]
[0041] PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)熱3分鐘；之后94°C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 1分鐘，共45 個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
[0042] (4) PCR產(chǎn)物鑒定
[0043] 取8 yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用I %瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成 像系統(tǒng)中，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來鑒定牧草盲蝽。如出現(xiàn)大小為220bp的DNA擴(kuò)增條帶，即 為牧草盲蝽（SEQ ID No. 3)。
[0044] 第二部分，引物L(fēng)P84-5F/LP84-5R對牧草盲蝽的特異性擴(kuò)增效果
[0045] 利用引物L(fēng)P84-5F/LP84-5R，以牧草盲蝽DNA為模板，以牧草盲蝽同域的35種其他 昆蟲（見表1)為對照進(jìn)行SS-COI PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，1、2泳道對應(yīng)的牧草盲蝽擴(kuò) 增出了 220bp的目的條帶，表明根據(jù)牧草盲蝽線粒體DNA COI基因設(shè)計的SS-COI引物的特 異性強，其220bp序列如SEQID No. 3所示。
[0046] 表1引物特異性檢測中所涉及的昆蟲種類

[0049] 第三部分，引物L(fēng)P84-5F/LP84-5R對牧草盲蝽最低檢出量的測定
[0050] (1)牧草盲蝽DNA模板的制備
[0051 ] 按第1部分的方法提取單頭牧草盲蝽基因組DNA，然后原模板濃度548ng/ μ L以5 倍進(jìn)行遞減稀釋至檢測不出條帶，取1 μ L作為PCR檢測的模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系 同第一部分所述。
[0052] 利用引物L(fēng)P84-5F/LP84-5R做最低檢出量的測定，牧草盲蝽的DNA最低檢出濃度 為0. 175ng/yL，結(jié)果如圖2所示。
[0053] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0054] 第四部分，試劑盒制作
[0055] 制作含有引物L(fēng)P84-5F和LP84-5R的用于檢測牧草盲蝽的試劑盒，本試劑盒包括 前述第一部分的所有材料，還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
【主權(quán)項】
1. 一種用于牧草盲蝽SS-COI PCR快速檢測的特異引物，其特征在于該引物為： 正向引物L(fēng)P84-5F: 5' -GGAGCAGGGACCGGATGAAC-3 ' 反向引物L(fēng)P84-5R: 5' -AAAGTAATAATAATGCGGTG-3 '。2. -種基于特異性SS-C0I引物的牧草盲蝽PCR快速檢測方法，其特征在于所述的檢測 步驟為： (1) 提取樣品DNA 在田間采集牧草盲蝽，放入離心管中將其磨碎，用試劑盒提取單頭盲蝽基因組總DNA， 將DNA溶液保存于-20°C備用； (2) 合成引物 合成如權(quán)利要求1所述的特異性SS-C0I引物； (3) PCR擴(kuò)增 以步驟⑴提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物L(fēng)P84-5F和LP84-5R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；PCR反應(yīng)體系以20 y L計為：PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)熱3分鐘；之后94°C30秒，58°C30秒，72°C1分鐘，共45個循 環(huán)；72°C延伸10分鐘。 (4)分析PCR產(chǎn)物 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像系統(tǒng)中， 如出現(xiàn)大小為220bp的DNA條帶，則表明樣品為牧草盲蝽。3. -種基于特異性SS-C0I引物的用于快速檢測牧草盲蝽的試劑盒，其特征在于該試 劑盒的引物為如權(quán)利要求1所述的特征引物，并且該試劑盒還包括牧草盲蝽DNA標(biāo)準(zhǔn)陽性 模板。
【專利摘要】牧草盲蝽SS-COI？PCR快速檢測特異引物、檢測方法及試劑盒。根據(jù)牧草盲蝽的線粒體DNA序列，設(shè)計一對牧草盲蝽的特異性SS-COI引物L(fēng)P84-5F和LP84-5R，該引物只對牧草盲蝽具有特異性擴(kuò)增效果，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為220bp，DNA最低檢出濃度為0.175ng/μL。該引物及其檢測方法和試劑盒用于植保領(lǐng)域牧草盲蝽優(yōu)勢天敵確定及食物鏈分析，特異性強，準(zhǔn)確率高，方便快捷。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105018629
【申請?zhí)枴緾N201510483157
【發(fā)明人】王冬梅, 丁瑞豐, 劉建, 李海強, 徐遙, 阿克旦, 李號賓, 潘洪生, 陸宴輝, 王劍, 汪飛, 張燕紅, 鄧菲菲
【申請人】新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月3日