生防菌株x1發(fā)酵培養(yǎng)基及小型發(fā)酵工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種枯草芽孢桿菌XI的發(fā)酵培養(yǎng)基及利用該 培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 拮抗能力強(qiáng)且抗菌譜廣的優(yōu)良菌種是中草藥土傳病害生物防治研究和微生物菌 劑研制的關(guān)鍵，而適宜的生產(chǎn)方法和培養(yǎng)條件則是發(fā)揮優(yōu)良菌種性能的保證。在篩選獲得 高效廣譜生防菌株后，為最終達(dá)到產(chǎn)業(yè)開發(fā)目的，需要對目的菌株進(jìn)行液體深層發(fā)酵研究， 包括適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基篩選、液體發(fā)酵條件的優(yōu)化和中試生產(chǎn)工藝的確定。
[0003] 搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐發(fā)酵對微生物的生長存在很大差異，將搖瓶發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)條件直 接放大到生產(chǎn)罐，菌株的生長往往不相一致。為了能夠適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需要，消除這兩種規(guī) 模發(fā)酵結(jié)果的差異，將搖瓶發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效的應(yīng)用到大型生產(chǎn)當(dāng)中去，就必須經(jīng)過實(shí) 驗(yàn)室小型發(fā)酵罐發(fā)酵條件研究。在了解菌株在發(fā)酵罐中的代謝規(guī)律的情況下，合理建立小 型發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝后，才能進(jìn)行中試規(guī)模的發(fā)酵研究或工廠規(guī)模的發(fā)酵研究。
[0004] 中間試驗(yàn)是小試完成后，在概念設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上進(jìn)行的，介于實(shí)驗(yàn)室裝置與工業(yè)裝置 之間的研究型試驗(yàn)，是工程研究的基礎(chǔ)，也是過程開發(fā)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。通過中試后，可使 工業(yè)裝置獲取相對較大的安全系數(shù)，及早發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室工作無法觀察到的現(xiàn)象，糾正設(shè)計(jì)中 可能出現(xiàn)的失誤。中試工作必須按工業(yè)化條件進(jìn)行，其目的和作用如下：（1)建立一定規(guī)模 的工業(yè)模擬裝置，對新工藝過程進(jìn)行全面模擬考察，明確操作條件和控制方法。（2)考察實(shí) 驗(yàn)室研究結(jié)果在工業(yè)規(guī)模下實(shí)現(xiàn)的技術(shù)及經(jīng)濟(jì)可行性。（3)考察工業(yè)因素對工藝過程和設(shè) 備的影響，發(fā)現(xiàn)和解決實(shí)際生產(chǎn)條件下可能發(fā)生的各種問題。
[0005] -般來說微生物在不同體積的反應(yīng)器中的生長速率是不同的，原因可能是，罐的 深度造成氧的溶解度、空氣停留時(shí)間和分布不同，剪切力不同，滅菌時(shí)營養(yǎng)成分破壞程度不 同所致。發(fā)酵罐的規(guī)模變化，無論是絕對值還是相對值都會引起許多物理和生物參數(shù)的改 變，從而很難使大、小規(guī)模過程中菌體所處的外界環(huán)境保持一致，在放大生產(chǎn)時(shí)就會常常出 現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)水平不穩(wěn)定或者發(fā)酵產(chǎn)率太低，最終導(dǎo)致研究成果長期停留在實(shí)驗(yàn)室的研究階 段，無法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。要將實(shí)驗(yàn)室研究中的優(yōu)化培養(yǎng)或發(fā)酵結(jié)果轉(zhuǎn)移到工業(yè)規(guī)模 的發(fā)酵生產(chǎn)過程中去，保證規(guī)模放大后能夠在大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中同樣取得成功的效 果，則需要進(jìn)行規(guī)模更大一些的發(fā)酵條件的研究或工廠規(guī)模的中間試驗(yàn)，以驗(yàn)證在實(shí)驗(yàn)室 研究階段的發(fā)酵工藝，然后才能放大到工廠規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種生防菌株XI發(fā)酵培養(yǎng)基及小型發(fā)酵工藝，為進(jìn)行該菌 株的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種生防菌株XI發(fā)酵培養(yǎng)基，包括如下成分：葡萄糖1. 0~1. 5%，酵母膏0. 5~ 0.8%，淀粉0? 1~0.3%，磷酸氫二鈉0.2~0.4%，磷酸二氫鈉0? 10~0.20%，硫酸鎂 0. 04~0.06 %，碳酸鈣0.05~0. 15 %，硫酸錳0.05~0. 15%，加蒸餾水至1000毫升，調(diào) 節(jié)pH7. 5-8. 0,115°C滅菌 25 分鐘。
[0009] -種利用上述培養(yǎng)基對生防菌株XI進(jìn)行小型發(fā)酵的工藝，包括如下步驟：
[0010] (1)用4~6mLNYD培養(yǎng)基活化存于-70°C冰柜中生防菌株XI，然后轉(zhuǎn)接入裝有 80~120mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于20~40°C，100~200r/min條件下培養(yǎng)16~ 18h，制成種子發(fā)酵液。
[0011] (2)將種子發(fā)酵液接種到裝有60~80L培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中通氣攪拌培養(yǎng)，保 持發(fā)酵溫度28~30°C;攪拌速度100~120r/min;通氣量0. 8~1. 0 (V/V?min);接種量 1. 5~2. 0% ;發(fā)酵時(shí)間36~40h。
[0012] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0013] 1、培養(yǎng)基簡單易得且成本低，所有成分可溶解，為生產(chǎn)后期處理方便可行；
[0014] 2、本發(fā)明對生防菌株XI進(jìn)行小型發(fā)酵罐的生產(chǎn)發(fā)酵，確定菌株自控發(fā)酵工藝，為 大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)依據(jù)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為菌株XI生長曲線（100L);
[0016] 圖2為不同培養(yǎng)時(shí)間菌液的pH值（100L)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，
[0018] 凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神 和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0019] 本發(fā)明提供了一種生防菌株XI的小型發(fā)酵工藝，包括以下內(nèi)容：
[0020] 1材料與方法
[0021] 1. 1 菌株
[0022]生防菌株 XI:CGMCCN0. 4037。
[0023] 1. 2培養(yǎng)基
[0024] 葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，淀粉0. 1%，磷酸氫二鈉0.3%，磷酸二氫鈉0. 15%， 硫酸鎂0. 05%，碳酸鈣0. 01 %，硫酸錳0. 01 %。調(diào)節(jié)PH7. 5-8. 0,115°C滅菌25分鐘。
[0025]1. 3生防菌株XI的100L自控罐液體深層發(fā)酵研究
[0026] 采用發(fā)酵罐（江蘇鎮(zhèn)江MCGS-100L)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其操作如下：
[0027] (1)培養(yǎng)前的發(fā)酵罐要做好準(zhǔn)備工作，確保電源供應(yīng)，檢查冷卻水水源，檢查空氣 氣源；在發(fā)酵罐內(nèi)注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基必須浸沒攪拌槳葉；打開排氣過濾器頂部的排氣閥；
[0028](2)在溫度控制器上設(shè)定發(fā)酵溫度和滅菌溫度；
[0029] (3)選擇控制模式中的"滅菌"項(xiàng)，滅菌開始；
[0030] (4)滅菌結(jié)束后，待溫度冷卻到發(fā)酵溫度后，在接種口上方點(diǎn)燃纏酒精棉的鐵圈， 打開接種口，接入培養(yǎng)好的種子液；選擇控制模式中的"發(fā)酵"項(xiàng)，發(fā)酵開始；
[0031](5)定時(shí)取發(fā)酵液，檢測菌濃度和芽孢形成狀況，確定最佳的培養(yǎng)時(shí)間。
[0032] 用5mLNYD培養(yǎng)基活化存于-70 °C冰柜中枯草芽孢桿菌菌種，然后轉(zhuǎn)接入裝有 100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于30°C，150r/min條件下培養(yǎng)18h，制成種子發(fā)酵液。 將種子發(fā)酵液按1.5%的接種量接種到裝有751培養(yǎng)基的（1?1^-1001)發(fā)酵罐中，在30 1€ 的條件下，保持通氧量在50%的水平，通氣攪拌培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中，每隔6h取樣測定發(fā)酵 液的〇D6。。值，繪制菌株生長曲線。另外每隔8h取樣測定發(fā)酵液的pH值。
[0033] 2結(jié)果與分析
[0034] 在生防菌株XI的中試發(fā)酵中，為了降低生產(chǎn)成本，提高芽孢形成率，用酵母膏替 代培養(yǎng)基中的牛肉膏，同時(shí)增加了MgS04、CaC03和、MnS0 43種無機(jī)鹽成分，以優(yōu)化的培養(yǎng)條 件（培養(yǎng)溫度30°(：，初始？11值7.5，接種齡16~1811)為基本條件，在751裝液量，1.5%接 種量下以轉(zhuǎn)速180r/min，通氣量1:1VVM進(jìn)行XI菌株100L罐的自控發(fā)酵。
[0035] 2. 1菌株生長曲線的測定
[0036] 在液體發(fā)酵過程中，菌體形態(tài)和菌液濃度直接反映菌株的生長情況。菌體形態(tài)可 通過顯微鏡觀察；菌液濃度的測定是衡量生產(chǎn)菌在整個(gè)培養(yǎng)過程中菌體量的變化。一般發(fā) 酵前期菌濃度增長很快，中期菌濃度基本恒定。在本發(fā)明中菌體生長延滯期很短，之后進(jìn)入 對數(shù)生長期，經(jīng)過24h對數(shù)生長期結(jié)束，菌體的生長轉(zhuǎn)入平穩(wěn)期（見圖1)，菌體在30h左右 開始形成芽孢，40h達(dá)到最大值，芽孢形成率達(dá)95%以上。
[0037] 2. 2發(fā)酵液pH值的測定
[0038] 發(fā)酵液pH值是微生物代謝的綜合反映，又影響代謝的進(jìn)行，所以是十分重要的參 數(shù)。在發(fā)酵過程中，隨著菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵液的pH必然會發(fā) 生變化，通過觀察pH值變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否。
[0039] pH值的變化是微生物代謝狀況的綜合反映一一基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營 養(yǎng)狀況、供氧狀況。在XI菌株100L自控罐發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液初始pH值調(diào)為7. 5,發(fā)酵 前期隨著菌體的生長和繁殖，發(fā)酵液的pH值逐漸下降，說明菌體大量利用糖產(chǎn)生了酸性物 質(zhì)。當(dāng)發(fā)酵至20h時(shí)，發(fā)酵液的pH值下降至6. 5,而后開始逐步回升，此時(shí)芽孢開始逐漸形 成，發(fā)酵至30h時(shí)，發(fā)酵液的pH值已升至7. 8,持續(xù)至下罐時(shí)，發(fā)酵液的pH值保持在8. 0左 右（見圖2)。
[0040] 2. 3發(fā)酵液活芽孢數(shù)的測定
[0041] 在XI菌株每一批100L自控罐發(fā)酵結(jié)束后，取菌液測定發(fā)酵液中的活芽孢數(shù)。結(jié) 果5批次發(fā)酵菌液的活芽孢數(shù)為14. 1~16. 3億/mL，平均為14. 9億/mL(見表1)。
[0042] 表1 XI菌株100L自控罐發(fā)酵結(jié)果
[0043]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生防菌株Xl發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖1.0 ~ 1. 5%，酵母膏0. 5~0. 8 %，淀粉0. 1~0. 3 %，磷酸氫二鈉0. 2~0. 4%，磷酸二氫鈉 0? 10~0.20%，硫酸鎂0.04~0.06%，碳酸鈣0.05~0? 15%，硫酸錳0.05~0? 15%，加 蒸餾水至1000毫升。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生防菌株Xl發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基配方如下： 葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，淀粉0. 1%，磷酸氫二鈉0.3%，磷酸二氫鈉0. 15%，硫酸鎂 0. 05%，碳酸鈣0. 01 %，硫酸錳0. 01 %。3. -種生防菌株Xl小型發(fā)酵工藝，其特征在于所述工藝步驟如下： (1) 用4~6mLNYD培養(yǎng)基活化存于-70°C冰柜中生防菌株XI，然后轉(zhuǎn)接入裝有80~ 120mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于20~40°C，100~200r/min條件下培養(yǎng)16~18h， 制成種子發(fā)酵液。 (2) 將種子發(fā)酵液接種到裝有60~80L培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)基 配方如下：葡萄糖I. 〇~1. 5 %，酵母膏0. 5~0. 8 %，淀粉0. 1~0. 3 %，磷酸氫二鈉0. 2~ 0. 4 %，磷酸二氫鈉0. 10~0. 20 %，硫酸鎂0. 04~0. 06 %，碳酸鈣0. 05~0. 15 %，硫酸錳 0. 05~0. 15 %，加蒸餾水至1000毫升，保持發(fā)酵溫度28~30°C;攪拌速度100~120r/ min;通氣量0? 8~I. 0V/V?min;接種量L5~2. 0% ;發(fā)酵時(shí)間36~40h。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生防菌株Xl小型發(fā)酵工藝，其特征在于所述培養(yǎng)溫度30°C， 裝液量75L，接種量1. 5%，轉(zhuǎn)速180r/min，通氣量I. 0V/V ? min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生防菌株X1發(fā)酵培養(yǎng)基及小型發(fā)酵工藝，所述培養(yǎng)基包括如下成分：葡萄糖1.0～1.5％，酵母膏0.5～0.8％，淀粉0.1～0.3％，磷酸氫二鈉0.2～0.4％，磷酸二氫鈉0.10～0.20％，硫酸鎂0.04～0.06％，碳酸鈣0.05～0.15％，硫酸錳0.05～0.15％，加蒸餾水至1000毫升，調(diào)節(jié)pH7.5-8.0，115℃滅菌25分鐘。小型發(fā)酵工藝如下：(1)用4～6mLNYD培養(yǎng)基活化存于-70℃冰柜中生防菌株X1，然后轉(zhuǎn)接入裝有80～120mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于20～40℃，100～200r/min條件下培養(yǎng)16～18h，制成種子發(fā)酵液。(2)將種子發(fā)酵液接種到裝有60～80L培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中通氣攪拌培養(yǎng)。本發(fā)明可為進(jìn)行該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/125
【公開號】CN105039230
【申請?zhí)枴緾N201510599801
【發(fā)明人】李晶, 于麗萍, 姜竹, 張淑梅, 孟利強(qiáng), 陳靜宇, 曹旭, 姜威, 劉宇帥, 胡基華
【申請人】黑龍江省科學(xué)院微生物研究所
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年9月18日