A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種粗多糖純化工藝，具體涉及的是A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化 工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦，下同）是一種由奈瑟氏腦膜炎球菌 (Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道傳染病。一百多年來，一直在世界各地流行或 散在發(fā)生，感染病原菌后可引起敗血癥、腦膜炎。易感人群主要為兒童，以暴發(fā)型病死率最 高，可達(dá)40%~60%。當(dāng)今世界各大洲發(fā)病率在1/10萬~10/10萬，總病死率在5%~15%， 高達(dá)20%的腦膜炎患者會有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括智力受損和耳聾等。根據(jù)莢膜多糖型別 進(jìn)行血清學(xué)分類可分13個血清型，其中A群、B群、C群約占流行菌群的90%。A群腦膜炎球 菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲"流腦流行帶"，每隔7-14年就會出 現(xiàn)一次較大流行。
[0003] 我國于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾發(fā)生過5次全國性流腦流 行；其中以1967年春季流行最為嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)403/10萬，病死率為5. 49%。我國過去 90%以上的病例是A群病菌致病，現(xiàn)在B群或C群病菌有時亦引起流腦暴發(fā)。2003年開始， C群流腦的發(fā)病率明顯上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有進(jìn)一 步增高的趨勢。因此，目前我國預(yù)防流腦工作的重點(diǎn)是以預(yù)防A群和C群為主。
[0004] 目前預(yù)防流行性腦脊髓膜炎最有效的方法是接種疫苗。研究表明，A群C群腦膜 炎球菌的莢膜多糖具有良好的免疫原性，提取莢膜多糖可直接制備成疫苗，經(jīng)注射免疫后 的人群可以獲得免疫保護(hù)。我國從2007年起已將流腦疫苗納入國家免疫規(guī)劃，在全國范圍 對適齡兒童普及接種。目前納入國家免疫計劃的流腦多糖疫苗包括A群腦膜炎球菌多糖疫 苗，A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗。
[0005] 目前，A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗的生產(chǎn)工藝均是從腦膜炎球菌莢膜中提取出 粗多糖，粗多糖經(jīng)過純化后獲得精糖，精糖經(jīng)過活化和衍生制成多糖-ADH衍生物，進(jìn)而有 效制成A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗。
[0006] 在粗多糖經(jīng)過純化后獲得精糖的生產(chǎn)過程中，由于粗多糖中含有多種雜質(zhì)，如：苯 酚、核酸及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，導(dǎo)致現(xiàn)有技術(shù)中粗多糖的純化的效率不高，精糖的獲取率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中粗多糖的純化的效率不高，精糖的獲取率較低 的問題，提供一種解決上述問題的A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝。
[0008] 為解決上述缺點(diǎn)，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，包括以下步驟： (1)將粗制多糖溶解于8%~12%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按體積比為1:0. 8~1. 2 的比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； (2) 收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸； (3) 在超濾后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl終濃度為0. 2~0. 4mol/L，然后 加入乙醇至乙醇體積終濃度為70~78%，充分混勻后2~8°C靜置過夜； (4) 離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖。
[0009] 進(jìn)一步，所述步驟（1)中飽和中性醋酸鈉溶液的濃度為10% ;冷酚與多糖和飽和中 性醋酸鈉溶液的混合液比例為1: 1。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中超濾膜包過濾時所用超濾液由濃度為0. 05mol/L的氯化 鈉溶液組成。
[0011] 作為最優(yōu)地設(shè)置方式，所述步驟（3)中NaCl終濃度為0. 3mol/L，乙醇體積終濃度 為 75%。
[0012] 更進(jìn)一步地，所述步驟（3)中NaCl溶液加入多糖溶液時的濃度為4mol/L，所述乙 醇加入使的濃度為95%。
[0013] 為了使提取出的精糖達(dá)到更好地質(zhì)量，所述步驟（4)中的干燥采用冷凍干燥方法。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 本發(fā)明的方法優(yōu)化了各化學(xué)物質(zhì)加入反應(yīng)時的比例和濃度，有效提高了精糖的純度和 回收率，本發(fā)明使精糖的純度達(dá)到95%以上。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0016] 實施例1 A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，包括以下步驟： (1) 將粗制多糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按體積比為1:1的比例加入冷 酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； (2) 收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸；本步驟中超濾膜包過濾時所 用超濾液由濃度為〇. 〇5mol/L的氯化鈉溶液組成； (3) 在超濾后的多糖溶液中加入4mol/L的NaCl溶液，直至NaCl終濃度為0. 3mol/L， 然后加入95%乙醇至乙醇體積終濃度為75%，充分混勻后2~8°C靜置過夜，沉淀； (4) 離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖。
[0017] 實施例2 本實施例與實施例1的區(qū)別僅僅在于，本實施例中各化學(xué)物質(zhì)加入反應(yīng)時的比例和濃 度不同，具體設(shè)置如下： 步驟（1)中將粗制多糖溶解于8%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按體積比為1:1. 2的比 例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； 步驟（3)中NaCl溶液濃度為2mol/L的，直至NaCl終濃度為0. 4mol/L，然后加入95% 乙醇至乙醇體積終濃度為70%，充分混勻后2~8°C靜置過夜。
[0018] 實施例3 本實施例與實施例1的區(qū)別僅僅在于，本實施例中各化學(xué)物質(zhì)加入反應(yīng)時的比例和濃 度不同，具體設(shè)置如下： 步驟（1)中將粗制多糖溶解于15%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按體積比為1:2的比 例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； 步驟（3)中NaCl溶液濃度為3mol/L的，直至NaCl終濃度為0· 5mol/L，然后加入95% 乙醇至乙醇體積終濃度為60%，充分混勻后2~8°C靜置過夜。
[0019] 對實施例1~3取樣，檢測精糖的純度和回收率，檢測結(jié)果如表1所示。
[0020] 表 1
通過上表可以看出，采用本發(fā)明濃度的各試劑進(jìn)行提純后，該提純的精糖的純度可達(dá) 95%以上，且回收率也更高。
[0021] 上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，但凡采用 本發(fā)明的設(shè)計原理，以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行非創(chuàng)造性勞動而作出的變化，均應(yīng)屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將粗制多糖溶解于8%~12%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按體積比為1:0. 8~1. 2 的比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，并抽提1~3次使上清液澄清； (2) 收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸； (3) 在超濾后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl終濃度為0. 2~0. 4mol/L，然后 加入乙醇至乙醇體積終濃度為70~78%，充分混勻后2~8°C靜置過夜； (4) 離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，其特征在于，所述步 驟（1)中飽和中性醋酸鈉溶液的濃度為10% ;冷酚與多糖和飽和中性醋酸鈉溶液的混合液 比例為1:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，其特征在于，所述步驟 (2) 中超濾膜包過濾時所用超濾液由濃度為0. 05mol/L的氯化鈉溶液組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，其特征在于，所述步驟 (3) 中NaCl終濃度為0. 3mol/L，乙醇體積終濃度為75%。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，其特征在于，所述步驟 (3)中NaCl溶液加入多糖溶液時的濃度為4mol/L，所述乙醇加入使的濃度為95%。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，其特征在于，所述步驟 (4 )中的干燥采用冷凍干燥方法。
【專利摘要】本發(fā)明公開的是A群腦膜炎球菌莢膜粗多糖純化工藝，解決了現(xiàn)有技術(shù)中粗多糖的純化效率不高、精糖的獲取率較低的問題。本發(fā)明包括以下步驟：（1）將粗多糖溶解于8%～12%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按體積比為1:0.8～1.2的比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；（2）收集上清液，用超濾膜包進(jìn)行超濾；（3）在超濾后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl終濃度為0.2～0.4mol/L，再加入乙醇至乙醇體積終濃度為70～78%，充分混勻后2～8℃靜置過夜；（4）離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖。本發(fā)明具有回收率高、純度高等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】A61P37/04, C08B37/00
【公開號】CN105061629
【申請?zhí)枴緾N201510543237
【發(fā)明人】朱沖, 米強(qiáng), 陳道遠(yuǎn)
【申請人】成都?xì)W林生物科技股份有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月31日