一種酶活提高的l-天冬酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-天冬醜胺酶（L-asparaginaseamidohydrolase，E.C. 3. 5. 1. 1)能夠?qū)-天冬 酰胺水解脫氨基形成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶具有抗腫瘤活性，目前已應(yīng)用于治療 急性淋巴細(xì)胞白血病及霍金森病等，近年來研究發(fā)現(xiàn)L-天冬酰胺酶還可以減少油炸食品 中丙烯酰胺的生成。L-天冬酰胺酶大小、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)因來源不同而有所不同。L-天冬酰胺 酶來源比較廣泛，豚鼠血清、植物以及微生物中都發(fā)現(xiàn)含有L-天冬酰胺酶。
[0003] 異源表達(dá)L-天冬酰胺酶突出的問題是，蛋白表達(dá)量低、L-天冬酰胺酶酶活低。因 此，定點(diǎn)突變改造L-天冬酰胺酶，提高胞外酶活，對于提高L-天冬酰胺酶工業(yè)化應(yīng)用前景 具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明首先提供了一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體，其氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0005] 編碼所述突變體的核苷酸序列是SEQIDN0. 3所示的序列。
[0006] 所述突變體是在氨基酸如序列SEQIDN0. 2所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將107位氨 基酸由甘氨酸突變成天冬氨酸。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)所述L-天冬酰胺酶突變體的基因工程菌。
[0008] 所述基因工程菌的制備方法，是在SEQIDN0. 4所示核苷酸序列的基礎(chǔ)上，將編碼 第107位的甘氨酸的密碼子突變成了編碼天冬氨酸的密碼子，得到重組基因，將重組基因 連接到表達(dá)載體得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主菌中即得到枯草芽孢桿 菌基因工程菌。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體是pMA5。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的制備方法，具體是：
[0011] (1)以SEQIDN0. 4所示核苷酸序列為模板，F(xiàn)lprimer(序列如SEQIDN0. 5所 示），Rlprimer(序列如SEQIDNO. 6所示）為引物，進(jìn)行PCR即得到SEQIDNO. 3所示的 重組基因G107D。
[0012] (2)將上一步得到的重組基因序列，連接到pMA5表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒 PMA5-G107D，重組質(zhì)?；D(zhuǎn)化B.subtilisl68,獲得重組枯草芽孢桿菌工程菌株，命名為 PMA5-G107D/B.subtilisl68。
[0013] 本發(fā)明在天然L-天冬酰胺酶的基礎(chǔ)上，通過定點(diǎn)突變生物技術(shù)改造L-天冬酰胺 酶分子結(jié)構(gòu)，突變體酶的純酶液比酶活較突變前提高83%。突變體酶G107D的底物親和力 I較突變前降低50%，而催化效率提高〇^31與!("的比值）84%。本發(fā)明表明107位氨基 酸殘基對酶的催化作用有較大影響，對該酶的催化機(jī)理的研究提供了一定的基礎(chǔ)，并提高 了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。本發(fā)明所得可用于制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病及霍金森病的藥 物，也可用于減少油炸食品中丙烯酰胺的生成。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1含L-天冬酰胺酶突變體的重組載體的構(gòu)建
[0015] (1)G107D突變體的獲得：以SEQIDN0. 4所示核苷酸序列為模板，F(xiàn)primer(序列 如SEQIDN0. 5所示）、Rprimer(序列如SEQIDN0. 6所示）為引物，進(jìn)行PCR即得到SEQ IDN0. 3所示的重組基因。
[0016] (2)將重組基因與pMA5分別用BamHI、Mlul雙酶切，純化后用T4DNA連接酶16°C 過夜連接。連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素（50mg/L)LB 平板，提取質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，命名為PMA5-G107D。測序工作由上海生工完 成。
[0017] 實(shí)施例2產(chǎn)L-天冬酰胺酶枯草芽孢桿菌工程菌構(gòu)建
[0018] 將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒pMA5-G107D化學(xué)法轉(zhuǎn)化入B.subtilisl68感受態(tài)細(xì) 胞，具體方法如下：
[0019] (1)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所需溶液如下（g/L):
[0020] Sp-A: (NH4) 2S044,K2HP0428,檸檬酸鈉 12Sp-B:MgS04 ? 7H200. 4
[0021] 100XCAYE:Casaminoacid20,酵母粉lOOSpI培養(yǎng)基：Sp-A49%，Sp-B49%，50% 葡萄糖 2%，100XCAYE2%SpII培養(yǎng)基：SpI培養(yǎng)基 98%，50mmol/LCaCl2l%，250mmol/ LMgCl2 1%。115°C濕熱滅菌。
[0022] (2)將B.Subtilisl68的單菌落接種至2mLSpI培養(yǎng)基中（50mL離心管），37°C、 200r/min培養(yǎng)過夜；
[0023] (3)取100yL培養(yǎng)液至5mLSpI培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至對數(shù)期（0D600 值為1左右），約4~5h;
[0024] (4)取200yL培養(yǎng)液至2mLSpII培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)90min，取出后 加入20yL10mmol/LEGTA，于37°C、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)10min，然后分裝成500yL每管，加 入5yL重組質(zhì)粒pMA5-G107D，混勻，37°C、200r/min培養(yǎng)90min，取菌液涂布抗性平板。37°C 培養(yǎng)12h，挑取陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。得到重組菌pMA5-G107D/B.subtilisl68。
[0025] 實(shí)施例3重組菌pMA5-G107D/B.subtilisl68L-天冬酞胺酶高效表達(dá)及酶活測定。
[0026] (1)將實(shí)施例2構(gòu)建的重組菌pMA5-G107D/B.subtilisl68與表達(dá)未突變的酶的對 照菌株pMA5-ansz/B.subtilisl68分別接種于10mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩 培養(yǎng)過夜，次日按4%的接種量轉(zhuǎn)接于枯草芽抱桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，取發(fā)酵 液于4°C、10000r/min離心10min，上清為胞外粗酶液，細(xì)胞破碎上清液為胞內(nèi)粗酶液，用于 酶活力的測定。
[0027] (2)枯草芽抱桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/L，K2HP04 2. 3g/L，KH2P04 1. 7g/L， 玉米衆(zhòng) 15g/L，尿素 3g/L，葡萄糖 40g/L，MgS04 0? 75g/L，NaC15g/L。調(diào)節(jié)pH6. 8-7. 0。
[0028](3)酶活定義：在40°C反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)能催化L-天冬酞胺轉(zhuǎn)化為1 iimolNH3 所需要的酶量為一個酶活單位。
[0029] (4) L-天冬酰胺酶酶活測定方法：以L-天冬酰胺為底物，通過測定在催化反應(yīng)中 釋放的冊13的量來測定酶活。反應(yīng)混合物（lmL)組成為：400yL25mML-天冬酰胺（溶解于 50mMpH7.5Tris-HCl) ;400 yL50mMpH7.5Tris-HCl ;100yL適當(dāng)濃度的酶溶液。反應(yīng)混合 物在40°C，pH7.5條件下，反應(yīng)15min后，加入100yL15% (W/V%)三氯乙酸溶液終止反 應(yīng)。以酶反應(yīng)前加入三氯乙酸終止反應(yīng)的反應(yīng)液作為空白對照。反應(yīng)混合物在20000g條 件下離心lOmin,取200uL上清液加入到4. 8mL的去離子水中。向上述體系中加入200yL 的奈斯勒試劑，測定在450nm波長下測吸光度，通過顯色反應(yīng)測酶反應(yīng)所釋放的NH3的量。
[0030] (3)結(jié)果表明重組菌pMA5-G107D/B. subtilisl68表達(dá)的L-天冬酰胺酶的總酶活 (胞內(nèi)與胞外酶活的總和）為96lU/mL，比對照菌株pMAf5-ansz/. subtilisl68 (534. 2U/mL) L_天冬酰胺酶酶活提高80%。
[0031] (4)步驟（1)得到的胞外粗酶液經(jīng)純化后得到L-天冬酰胺酶G107Dansz，分析純化 后的重組L-天冬酰胺酶G107DansJ|學(xué)性質(zhì)，如表1，底物親和力K"較突變前降低50%，催 化效率keat/U是高84%，同時(shí)比酶活提高83%。由于催化效率的提高，增加了G107D_的 比酶活。
[0032]表1 G107DanszS應(yīng)動力學(xué)參數(shù)
[0033]
[0034] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種L-天冬酰胺酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. I 所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。3. -種含有權(quán)利要求2所述基因的重組表達(dá)載體。4. 一種表達(dá)權(quán)利要求1所述L-天冬酰胺酶突變體的基因工程菌。5. -種制備權(quán)利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，是在SEQ ID NO. 4所示序 列的基礎(chǔ)上，將第107位甘氨酸突變成天冬氨酸，得到重組基因，將重組基因連到表達(dá)載體 得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主菌中即得到枯草芽孢桿菌基因工程菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述方法具體是：（1)以SEQ ID NO. 4 所示核酸序列為模板，以序列如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示的引物，進(jìn)行PCR，即得到 編碼的107位氨基酸由甘氨酸突變成天冬氨酸的G107D突變體基因序列；(2)將上一步得 到的重組基因序列，連接到PMA5表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pMA5-G107D，重組質(zhì)?；D(zhuǎn)化 B. Subti I i s，獲得重組枯草芽孢桿菌基因工程菌。7. 權(quán)利要求1所述L-天冬酰胺酶突變體在制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病及霍金森病 的藥物中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述L-天冬酰胺酶突變體在減少油炸食品中丙烯酰胺生成中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶活提高的L-天冬酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明的突變體是在SEQ？ID？N0.2所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將第107位甘氨酸突變成天冬氨酸。本發(fā)明得到的突變體在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，搖瓶發(fā)酵24h后酶活為961U/mL，突變酶活提高了80％，底物親和力較原始酶降低50％，催化效率提高84％，同時(shí)比酶活提高83％。本發(fā)明表明107位氨基酸殘基對酶的催化作用有較大影響，對該酶的催化機(jī)理的研究提供了一定的基礎(chǔ)，并提高了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。
【IPC分類】C12N15/55, A23L1/01, C12R1/125, C12N1/21, A61P35/02, C12N9/82, A61K38/50
【公開號】CN105062997
【申請?zhí)枴緾N201510526470
【發(fā)明人】饒志明, 龍水清, 張顯, 楊套偉, 徐美娟
【申請人】江南大學(xué), 江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所, 如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月25日