[0027] 5、siRNA療法開發(fā)-SRS和RSS面臨的挑戰(zhàn)
[0028]FabozziG等發(fā)現(xiàn)，除了病毒蛋白35(VP35)之外，VP30和VP40獨立充當SRS，RNA 沉默的抑制因子（SRS)。他們已經(jīng)證明了VP30和VP35的分子機制。僅在siRNA存在的情 況下，VP30和獨立于siRNA的Dicer和一個Dicer伴侶（TRBP)相互作用。VP35以一種獨立 于siRNA的方式，在對干擾素（IFN)不產(chǎn)生作用的情況下，直接和Dicer伴侶TRBP和PACT相互作用。結(jié)合這兩點，他們的發(fā)現(xiàn)闡明了RNAi抑制的一種新機制，這就延伸到了SRS在 雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合和IFN拮抗中所起作用之外。三個抑制因子的存在凸顯了EBOV感染 中宿主RNAi依賴的抗病毒免疫的關(guān)聯(lián)性，還闡明了RNAi在影響RNA病毒變異過程中的重 要性。
[0029]ZhuY.和其同事發(fā)現(xiàn)，埃博拉病毒（EB0V)VP35是一個毒力因子，能阻斷先天的抗 病毒宿主反應，包括a干擾素的誘導和相關(guān)反應。VP35也是一個RNA沉默抑制因子 (RSS)。通過抑制微RNA指導的沉默（microRNA-directedsilencing)，哺乳動物病毒RSS 能夠改變有益于病毒復制的細胞環(huán)境。一個包含特異性微RNA靶向序列的報告基因證明： 野生型VP35的優(yōu)先表達可以阻斷哺乳動物細胞的微RNA沉默。另外，野生型VP35C末端結(jié) 構(gòu)域（CTD)的蛋白質(zhì)融合物結(jié)合小干擾RNA(siRNA)。突變蛋白的分析表明，RSS試驗中報 告基因的活性跟它們對抗雙鏈RNA(dsRNA)活化的蛋白激酶R(PKR)或結(jié)合siRNA的能力并 沒關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，VP35存在的情況下，報告基因活性的增強代表著非特異性翻譯的增強 和沉默的抑制。此外，哺乳動物細胞中特定的RSS活性絕大多數(shù)和RNA結(jié)合無關(guān)，與VP35 在隔離（sequester) -個或多個沉默復合蛋白中的作用一致。為了檢驗不含干擾素體系中 RSS的活性，他們還在充分表征的植物沉默抑制試驗中測試了VP35。結(jié)果顯示，VP35具有 很強的RSS活性，并且突變蛋白的活性跟RNA結(jié)合活性密切相關(guān)，但不限于僅跟RNA結(jié)合活 性密切相關(guān)。結(jié)果表明，在不能擴增dsRNA的哺乳動物體系中，VP35蛋白的相互作用在阻 斷沉默中具有重要作用。
[0030] 6、siRNA療法開發(fā)-導入障礙面臨的挑戰(zhàn)
[0031] 保護肺部免受外來顆粒物的影響有很多生物屏障和因素，如厚的彈性粘液層可能 結(jié)合吸入藥物并通過黏液清除機制將藥物清除，分化良好的氣道上皮細胞表面的低基底和 刺激率，細胞內(nèi)和細胞外的核糖核酸酶，以及靶細胞內(nèi)的降解系統(tǒng)等。克服呼吸道導入和有 效地進入細胞發(fā)揮作用方面的難題會為siRNA作為系統(tǒng)EVD療法鋪平道路。此外，導入載 體和給藥方式必須符合感染的階段，并且在作用部位最快發(fā)生作用，如在成纖維細胞和內(nèi) 皮細胞的早期感染階段/預防階段，疾病晚期通過全身給藥。其中，通過靜脈輸入給藥治療 疾病最有效。在疾病大流行的背景下，靜脈輸入的給藥方式能夠更容易地對患者直接用藥。 此外，埃博拉病毒能夠感染血管內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞能夠表達促進病毒進入細胞的特異性 受體，這兩個發(fā)現(xiàn)將會促進血管內(nèi)皮細胞直接導入抗病毒物質(zhì)這種導入方式的開發(fā)，以控 制病毒引起的一些系統(tǒng)癥狀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0032] 為克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提供了一種可抑制埃博拉病毒基因復制的 活性分子，及其在細胞和動物模型中檢測沉默埃博拉病毒基因的分子活性的方法，以及作 為新型抑制埃博拉病毒復制的方法。
[0033] 本發(fā)明利用治療性小干擾RNA(siRNA)制劑和導入系統(tǒng)來抑制埃博拉病毒的基因 表達，并治療EVD患者。EVD患者感染埃博拉病毒后通常會有一個2-21天的潛伏期。這個 疾病的第1階段沒有什么特殊性，癥狀有極度乏力、腹瀉、惡心和嘔吐，伴厭食腹痛、頭痛、 關(guān)節(jié)痛（關(guān)節(jié)神經(jīng)痛）、肌痛、腰痛、口腔黏膜發(fā)紅和吞咽困難。第二階段的癥狀容易區(qū)分， 如出血、精神異常、無尿和打嗝。
[0034] 靶標選擇
[0035] 埃博拉病毒屬是絲狀病毒科（filovirus)的一員。埃博拉病毒屬有5種亞型：扎 伊爾埃博拉病毒（EB0V)、蘇丹埃博拉病毒（SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒（TAFV)、雷斯頓埃 博拉病毒（RESTV)和本迪布焦埃博拉病毒（BDBV)，其中EB0V、SUDV和BDBV造成了西非EVD 的大爆發(fā)。EB0V在圓柱形/管狀的病毒顆粒中攜帶有負鏈RNA基因組，還包含病毒包膜、基 質(zhì)和核衣殼組分。整個病毒顆粒圓柱體通常直徑約80nm，并且在脂質(zhì)雙分子層表面黏附有 一個突出7-10nm的病毒編碼的糖蛋白（GP)。圓柱體有不同的長度，通常是800nm，但有時 可長達lOOOnm。病毒顆粒外面的病毒包膜由宿主細胞膜出芽形成，在其生物形成過程中GP 就已插入其中。單個GP分子通常以10nm的間距出現(xiàn)。
[0036] 病毒蛋白VP40和VP24位于病毒包膜和核衣殼之間（如下），位于基質(zhì)中。病毒顆 粒結(jié)構(gòu)的中心是核衣殼，由一系列黏附于18_19kb線性負鏈RNA(沒有3'-多聚腺甘酸或 5' -帽端（如下））的病毒蛋白組成；RNA螺旋纏繞在一起，并結(jié)合著NP、VP35、VP30和L蛋 白；這個RNA螺旋體直徑為80nm，包含一個直徑20-30nm的中心通道（圖1)。純化和可視 化之后（如分別通過離心和電子顯微鏡）病毒顆粒的整體形狀有很大差別；簡單的圓柱體 遠不如反向的結(jié)構(gòu)、分支和環(huán)（如U形、shepherd's crook、9形或eye bolt-shapes、或其 他形狀或圓形/盤繞狀）普遍，這可能源于實驗室技術(shù)的應用。然而，"絲狀"結(jié)構(gòu)是絲狀病 毒（GP修飾的病毒包膜，RNA核衣殼等）的一個更普遍的形態(tài)學特征。
[0037] 每個病毒顆粒都包含一個線性的單股負鏈RNA分子，含18959至18961個核苷酸， 沒有3' -多聚腺甘酸和5' -帽端。此外，還發(fā)現(xiàn)來自3'末端的472個核苷酸和來自5' 末端的731個核苷酸足以讓病毒復制。[9]埃博拉病毒顆粒編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白和一個非結(jié) 構(gòu)蛋白?；蚺帕许樞驗?3' -頭端（leader)-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-尾端 (trailer)-5' ；頭端和尾端沒有轉(zhuǎn)錄域，但攜帶控制轉(zhuǎn)錄、復制和將病毒基因組組裝成新病 毒顆粒的重要信號?；蚪M本身不具有傳染性，因為將病毒基因組轉(zhuǎn)錄為mRNA需要病毒蛋 白中RNA依賴的RNA聚合酶，由于其是負鏈RNA病毒，病毒基因組的復制也一樣。在幾組小 型哺乳動物的基因組中，來自絲狀病毒的部分NP、VP35和L基因被確定是內(nèi)源性的。
[0038] 因為是非細胞結(jié)構(gòu)，像埃博拉這樣的病毒不會通過任何形式的細胞分裂來復制； 相反，它們利用宿主和病毒編碼的酶，沿著宿主細胞結(jié)構(gòu)進行自我復制，產(chǎn)生多個拷貝；然 后，這些拷貝在宿主細胞中自組裝成病毒大分子結(jié)構(gòu)。當感染各個單獨的細胞時，病毒要完 成一組步驟：病毒首先通過糖蛋白（GP)表面的病毒包膜顆粒與宿主受體結(jié)合發(fā)生攻擊，并 在宿主細胞中內(nèi)吞為微小的吞飲體（macropinosomes)。為了滲入細胞，病毒膜和囊泡膜融 合在一起，核衣殼釋放到細胞質(zhì)中。衣殼化的負鏈基因組ssRNA當做聚腺甘酸、單順反子 mRNA和tRNA分子（利用宿主細胞核糖體）等合成（3' -5'）的模板，mRNA被翻譯成單個的 病毒蛋白。
[0039] 這些病毒蛋白還要經(jīng)過加工處理，糖蛋白前體（GP0)裂解為GP1和GP2,然后在細 胞酶和底物的作用下，GP1和GP2被高度糖基化。GP1和GP2首先組裝成異質(zhì)二聚體，然后 組裝成三聚體，形成表面病毒包膜顆粒。分泌糖蛋白（sGP)前體裂解為sGP和delta多肽， 這兩種物質(zhì)都會被細胞釋放。當病毒蛋白水平升高時，翻譯轉(zhuǎn)為復制。將負鏈基因組RNA 作為模板，來合成互補+ssRNA;之后所合成的互補+ssRNA作為合成新基因組（-)ssRNA的 模板，新合成的基因組（_)ssRNA很快殼體化。新形成的核殼體和包膜蛋白在宿主細胞的細 胞質(zhì)膜進行組裝；然后出芽，破壞細胞。
[0040] 如上所述，F(xiàn)abozziG等發(fā)現(xiàn)除了病毒蛋白35(VP35)之外，VP30和VP40也獨立充 當RNA沉默抑制劑（SRS)。他們已經(jīng)證明了VP30和VP35的分子機制。僅在siRNA存在的 情況下，VP30和獨立于siRNA的Dicer和一個Dicer分子伴侶（TRBP)相互作用。VP35以 一種獨立于siRNA的方式，在對干擾素（IFN)不產(chǎn)生作用的情況下，直接和Dicer伴侶TRBP 和PACT相互作用。結(jié)合這兩點，他們的發(fā)現(xiàn)闡明了RNAi抑制的一種新機制，這就延伸到了 SRS在雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合和IFN對抗中所起作用之外。三個抑制因子的存在凸顯了EB0V 感染中宿主RNAi依賴的抗病毒免疫的關(guān)聯(lián)性，還闡明了RNAi在影響RNA病毒變異過程中 的重要性。
[0041] 基于以上信息，我們決定選擇埃博拉病毒的VP24、VP30、VP35、VP40和聚合酶L作 為siRNA雞尾酒介導療法的靶標。本發(fā)明提供了 17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸 長度的雙鏈siRNA分子序列，所述的siRNA分子抑制埃博拉病毒VP24、VP30、VP35、VP40和 聚合酶L的表達。該siRNA分子兩端為鈍端（平末端），或在雙鏈兩側(cè)的3'端懸掛有一個 或多個核苷酸。本發(fā)明所提供的siRNA雞尾酒包含靶向埃博拉病毒VP24、VP30、VP35、VP40 和聚合酶L的兩條、三條、四條或多條siRNA序列。通過靶向埃博拉病毒VP24、VP30、VP35、 VP40和聚合酶L，siRNA可誘導特定的病毒mRNA裂解。
[0042] 保守病毒基因組
[0043] 埃博拉病毒屬是絲狀病毒科（filovirus)的一員。埃博拉病毒屬有5種亞型：扎 伊爾埃博拉病毒（EB0V)、蘇丹埃博拉病毒（SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒（TAFV)、雷斯頓埃 博拉病毒（RESTV)和本迪布焦埃博拉病毒（BDBV)，其中EB0V、SUDV和BDBV造成過西非EVD 的大爆發(fā)。本發(fā)明提供了靶向三種典型埃博拉病毒亞型EBOV、SUDV和BDBV保守區(qū)域的 siRNA分子，這三種亞型曾在非洲引起大規(guī)模EVD爆發(fā)。SUDV的完整基因組序列已經(jīng)得到 闡述，如，GenbankAccessionNos.KC242783 ;AY729654 ;EU338380 ;FJ968794 和KC545389。 BDBV的完整基因組序列也已經(jīng)得到闡述，如GenbankAccessionNos.KC545393 ;FJ217161 ; KC545396和KC545393。編碼埃博拉病毒VP24、VP30、VP40和聚合酶L的三種亞型的保守區(qū) 域被選擇用來作為siRNA分子序列。如表1所述，我們匹配（align) 了所有已公布的21條 病毒序列，然后設(shè)計了靶向五個所選基因的siRNA序列（表1)。
[0044] siRNA設(shè)計和序列篩選
[0045] 利用生物信息學程序，我們已經(jīng)確定了 25mer的鈍端siRNA，來干擾對埃博拉病毒 復制周期至關(guān)重要的關(guān)鍵基因域。這些關(guān)鍵基因包括VP24、VP30、VP35、VP40和聚合酶L基 因，但埃博拉病毒株的每一個基因都可以包含在這個列表中。siRNA預測軟件確定給定長度 的siRNA(具有一個懸掛端的21個堿基（mer)的siRNA，或含25個堿基的鈍端雙鏈RNA)， 該siRNA和我們選擇沉默的基因一致。
[0046] 軟件能給出具有合適熱力學性質(zhì)的siRNA，去除已知的具有免疫刺激性的序列和 那些GC含量（35-65% )不適當?shù)膕iRNA。滿足我們最終標準的siRNA序列列表會輸入到 一個文件中，并且保存在電腦硬盤中。另一個軟件工具會打開siRNA列表文件，并按順序檢 查數(shù)據(jù)庫中的每條siRNA序列，以確保所預測siRNA序列和病毒株基因序列的一致性?？?能需要做兩個檢索：1)siRNA序列和基因序列所有堿基精確一致；2)部分匹配-siRNA中的 特定堿基和所要匹配的基因序列不完全匹配。在第二種情況中，軟件如果用大寫字母（如CCATCGTTCCAAGGGTACGGCATAA)輸出siRNA序列，意味著具有該序列的siRNA和靶基因中的 互補序列完全匹配，在這種情況下，匹配率將為100%。如果siRNA和所預測的基因序列不 一致，則堿基將會用小字母表示。例如，一個siRNA的序列和靶基因的互補序列完全匹配， 但是最后一個堿基不同，則表示為CCATCGTTCCAAGGGTACGGCATAa。眾所周知，能高效沉默相 關(guān)基因的siRNA的最短有效長度為19個堿基的雙鏈siRNA。這里給出的這個例子是所預測 的 25mer的siRNA。
[0047] 之前我們已經(jīng)證明，在體外基因沉默中25mer的siRNA比19mer的siRNA更有效。 為了確保siRNA具有最佳熱力學性質(zhì)，頭兩個堿基應不含T或A，雖然這比siRNA的最后兩 個堿基是T或A要好。原因就是，A和T使雙鏈siRNA更容易解開并和Dicer中的反義鏈 配對。然而很多siRNA具有一致性的區(qū)域的末端可能會含有T和A，有時確定siRNA該區(qū) 域的絕對一致性是不可行的。因此，如果siRNA的末端區(qū)域的堿基不能精確配對，這可能有 助于提高siRNA的療效。所以，我們篩選預測siRNA序列的算法為滿足我們所有標準（整 個siRNA堿基序列的一致性，并且序列中的頭兩個堿基和末尾兩個堿基是正確的堿基）的 siRNA提供了一個加權(quán)。根據(jù)如下公式對序列進行加權(quán)：[(預測siRNA長度-有效siRNA 的最小長度）* (連續(xù)的堿基配對數(shù)）V(堿基錯配數(shù)+1)。如，在我們的示例中，25mer的 siRNA序列如下計算[(25-19) *(25)]/I= 150。
[0048]如果 25mer的siRNA的序列為CCATCGITCCAAGGGTACGGCATAA，若末端有 一個堿基配錯了，值應該為[(25-19)*(24)]/2 = 72。若序列為CCATCGTTCCAAGGGTAC GTCATAA，值為[(25-19) *(19)]/2 = 57,因此，一個離末端較遠的堿基配對出錯的話會降 低值。此外，若序列為CCATCGTTCCAAGGGTACGTTCCGG，末端的六個堿基都配錯的 話，值應為[(25-19)*(19)]/6) = 19。通過這個值可以估算如何排列感興趣的抗病毒株的 siRNA?；?