一種添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物制藥領(lǐng)域，涉及了一種亞油酸緩釋微囊制備以及其在利普斯他汀發(fā)酵中的應(yīng)用，具體地說(shuō)涉及一種添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利普斯他汀是由毒三素鏈霉菌i Streptomyces toxytricini')產(chǎn)生的內(nèi)源性脂肪酶抑制劑，經(jīng)催化加氫后生成奧利司他，是目前唯一非中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制的減肥藥。奧利司他有兩種生產(chǎn)工藝，一種是化學(xué)合成法，另一種是半合成法，即先經(jīng)生物發(fā)酵獲得利普斯他汀，再氫化得到奧利司他。
[0003]目前半合成法是工業(yè)化生產(chǎn)奧利司他的主要方法。其中利普斯他汀的發(fā)酵和純化是關(guān)鍵工藝，在發(fā)酵過(guò)程中通常會(huì)補(bǔ)加不飽和脂肪酸油酸、亞油酸等作為前體，但是這些脂肪酸的過(guò)量補(bǔ)加會(huì)對(duì)菌體造成毒害，而且不易于下游提取純化。專利US20110014664A1采用直接補(bǔ)加亞油酸、油酸以及λ-9脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)利普斯他汀，效價(jià)可達(dá)到5g/L，但該工藝補(bǔ)加脂肪酸種類多，生產(chǎn)成本高，并且不利于下游分離純化。W02007134836、W02007078263描述了直接補(bǔ)加亞油酸和氨基酸的工藝，但是發(fā)酵效價(jià)低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)問(wèn)題:在利普斯他汀發(fā)酵過(guò)程中間歇補(bǔ)加亞油酸不但會(huì)增加發(fā)酵液粘度，降低氧傳遞，影響微生物對(duì)溶氧的需要，而且間歇補(bǔ)加會(huì)造成亞油酸短時(shí)高濃度，對(duì)菌體細(xì)胞有毒害作用。本發(fā)明通過(guò)制備亞油酸緩釋微囊控制亞油酸緩慢釋放，解決了上述問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明技術(shù)方案如下
(I)將亞油酸與2-8%海藻酸鈉溶液混合，亞油酸質(zhì)量含量3-7%，然后加入非離子乳化劑進(jìn)行攪拌均質(zhì)，乳化劑用量0.1-1%，組成溶液I。
[0006](2)將氯化鈣加入冰醋酸溶液中，氯化鈣用量1_5%，溶解后加入殼聚糖，殼聚糖用量0.5-3%，組成溶液2。
[0007](3 )用注射器抽取溶液I緩慢逐滴滴入溶液2中，形成微球。
[0008](4)冰浴冷卻至8-10° C，加入溶液2體積1_3%的交聯(lián)劑，交聯(lián)劑可以是戊二醛或甘油醛，或二者的組合物，交聯(lián)過(guò)程攪拌速度控制在100-300rpm。
[0009](5)真空抽濾獲得微球，然后依次用乙醇和蒸餾水各洗滌3次。
[0010](6)真空干燥48-60h獲得亞油酸緩釋微囊，干燥溫度35-45° C。
[0011](7)配制利普斯他汀發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)121° C，30min消毒滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境下接入5-15%經(jīng)75%乙醇處理和紫外消毒的亞油酸微球，并設(shè)置陰性對(duì)照。
[0012](8)在無(wú)菌環(huán)境下向發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL/500mL三角瓶)中接入5%預(yù)先培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度27° C，轉(zhuǎn)速200-250 rpm，發(fā)酵時(shí)間140h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定利普斯他汀的效價(jià)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]
本發(fā)明由下述實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于如下實(shí)施例。
[0014]實(shí)施例1
(I)稱取1g海藻酸鈉溶于200ml水中，邊攪拌邊加熱，待溶解后加入6g亞油酸混合，同時(shí)加入0.5g Span-20乳化劑進(jìn)行均質(zhì)乳化，均質(zhì)時(shí)間lOmin，轉(zhuǎn)速5000-8000rpm，均質(zhì)結(jié)束后為穩(wěn)定的乳白色液體，為溶液I。
[0015](2)稱取5g氯化鈣溶于200ml冰醋酸中，溶解后加入殼聚糖2g，混合均勻后組成溶液2。
[0016](3)用20ml注射器配7號(hào)針頭抽取溶液I緩慢逐滴滴入溶液2中，形成微球，控制滴速為 60-70d/min。
[0017](4)將微球混懸液用冰浴冷卻至10° C，加入4ml戊二醛交聯(lián)劑，交聯(lián)過(guò)程攪拌速度控制在150 rpm，交聯(lián)時(shí)間6h。
[0018](5)真空抽濾獲得微球，然后依次用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌3次。
[0019](6)真空干燥48_60h獲得亞油酸緩釋微囊，干燥溫度40° C。
[0020](7)配制利普斯他汀發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)121° C，30min消毒滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境下接入5%經(jīng)75%乙醇處理和紫外消毒2h的亞油酸微球，并設(shè)置陰性對(duì)照。
[0021](8)在無(wú)菌環(huán)境下向發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL/500mL三角瓶)中接入5%預(yù)先培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度27° C，轉(zhuǎn)速200-250 rpm，發(fā)酵時(shí)間140h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定利普斯他汀的效價(jià)為4.27g/L，比陰性對(duì)照提高13%。
[0022]實(shí)施例2
(I)稱取1g海藻酸鈉溶于200ml水中，邊攪拌邊加熱，待溶解后加入10 g亞油酸混合，同時(shí)加入0.5g Span-20乳化劑進(jìn)行均質(zhì)乳化，均質(zhì)時(shí)間lOmin，轉(zhuǎn)速5000-8000rpm，均質(zhì)結(jié)束后為穩(wěn)定的乳白色液體，為溶液I。
[0023](2)稱取5g氯化鈣溶于200ml冰醋酸中，溶解后加入殼聚糖2g，混合均勻后組成溶液2。
[0024](3)用20ml注射器配7號(hào)針頭抽取溶液I緩慢逐滴滴入溶液2中，形成微球，控制滴速為 50-60 d/min。
[0025](4)將微球混懸液用冰浴冷卻至10° C，加入4ml戊二醛交聯(lián)劑，交聯(lián)過(guò)程攪拌速度控制在200 rpm，交聯(lián)時(shí)間6h。
[0026](5)真空抽濾獲得微球，然后依次用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌3次。
[0027](6)真空干燥48_60h獲得亞油酸緩釋微囊，干燥溫度40° C。
[0028](7)配制利普斯他汀發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)121° C，30min消毒滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境下接入10%經(jīng)75%乙醇處理和紫外消毒2h的亞油酸微球，并設(shè)置陰性對(duì)照。
[0029](8)在無(wú)菌環(huán)境下向發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL/500mL三角瓶)中接入5%預(yù)先培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度27° C，轉(zhuǎn)速200-250 rpm，發(fā)酵時(shí)間140h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定利普斯他汀的效價(jià)為4.81g/L，比陰性對(duì)照提高21%。
[0030]實(shí)施例3
(I)稱取1g海藻酸鈉溶于200ml水中，邊攪拌邊加熱，待溶解后加入14 g亞油酸混合，同時(shí)加入0.5g Span-20乳化劑進(jìn)行均質(zhì)乳化，均質(zhì)時(shí)間15 min，轉(zhuǎn)速8000-10000rpm，均質(zhì)結(jié)束后為穩(wěn)定的乳白色液體，為溶液I。
[0031](2)稱取5g氯化鈣溶于200ml冰醋酸中，溶解后加入殼聚糖4g，混合均勻后組成溶液2。
[0032](3)用20ml注射器配7號(hào)針頭抽取溶液I緩慢逐滴滴入溶液2中，形成微球，控制滴速為 50-60 d/min。
[0033](4)將微球混懸液用冰浴冷卻至10° C，加入4ml戊二醛交聯(lián)劑，交聯(lián)過(guò)程攪拌速度控制在200 rpm，交聯(lián)時(shí)間8h。
[0034](5)真空抽濾獲得微球，然后依次用無(wú)水乙醇和蒸餾水各洗滌3次。
[0035](6)真空干燥48_60h獲得亞油酸緩釋微囊，干燥溫度40° C。
[0036](7)配制利普斯他汀發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)121° C，30min消毒滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境下接入15%經(jīng)75%乙醇處理和紫外消毒2h的亞油酸微球，并設(shè)置陰性對(duì)照。
[0037](8)在無(wú)菌環(huán)境下向發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL/500mL三角瓶)中接入5%預(yù)先培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度27° C，轉(zhuǎn)速200-250 rpm，發(fā)酵時(shí)間140h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定利普斯他汀的效價(jià)為5.23g/L，比陰性對(duì)照提高26%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:(1)首先制備亞油酸緩釋微囊，方法如下:將亞油酸與海藻酸鈉溶液混合，加入非離子乳化劑均質(zhì)乳化；將上述溶液勻速滴入含有殼聚糖和氯化鈣的冰醋酸溶液中，形成微球，冷卻至室溫后，加入無(wú)毒交聯(lián)劑，抽濾乙醇洗滌，經(jīng)真空低溫干燥后得到亞油酸緩釋微囊；(2)將制備好的微囊添加到利普斯他汀發(fā)酵瓶中，利普斯他汀發(fā)酵單位提高22-25%左右。2.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:乳化劑為烷基酚聚氧乙烯醚(OP-1O)、失水山梨醇單月桂酸酯(Span-20)或吐溫20，添加量為0.1-1%。3.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-8%。4.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3-7%。5.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:冰醋酸的添加量為2-5%。6.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:殼聚糖的添加量為0.5-3%。7.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:氯化鈣的添加量為1_5%。8.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:制備亞油酸微囊所用交聯(lián)劑為戊二醛或甘油醛，或它們的組合物，用量為1_3%。9.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:制備亞油酸微囊是攪拌速率為100-300 rpm。10.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:亞油酸微囊干燥溫度為35-45° Co11.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:亞油酸微囊在搖瓶發(fā)酵中添加量為5-15%。12.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:利普斯他汀種子培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件為葡萄糖0.5-1.0%，蛋白胨1.0-3.0%，酵母粉 1.5-2.5%，硫酸鎂 0.05-0.2%，磷酸二氫鉀 0.1-0.5%，ρΗ7.0-7.2，培養(yǎng)溫度 27。C，轉(zhuǎn)速200-250 rpm，發(fā)酵時(shí)間40-48h，裝液量50 mL/250mL三角瓶。13.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:利普斯他汀發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.5-1.0%，黃豆粉2.0-5.0%，豆油0.5-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.2%，磷酸二氫鉀 0.1-0.5%，ρΗ7.0-7.2。14.按照權(quán)利要求1所述的添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法，其特征在于:利普斯他汀發(fā)酵所用菌株為毒三素鏈霉菌，發(fā)酵溫度27° C，轉(zhuǎn)速200-250 rpm,發(fā)酵時(shí)間140h，裝液量100 mL/500mL三角瓶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種添加亞油酸緩釋微囊提高利普斯他汀發(fā)酵單位的方法。首先是制備亞油酸緩釋微囊，方法如下：將亞油酸與海藻酸鈉溶液混合，加入非離子乳化劑均質(zhì)乳化；將上述溶液勻速滴入含有殼聚糖和氯化鈣的冰醋酸溶液中，形成微球，冷卻至室溫后，加入無(wú)毒交聯(lián)劑，抽濾并用乙醇和蒸餾水洗滌，經(jīng)真空低溫干燥后得到亞油酸緩釋微囊。將制備好的微囊添加到利普斯他汀發(fā)酵瓶中，利普斯他汀發(fā)酵單位提高22-25%。本發(fā)明有效延長(zhǎng)了亞油酸的釋放時(shí)間，提高了利普斯他汀的產(chǎn)量，而且解決了添加高濃度亞油酸對(duì)毒三素鏈霉菌的毒性問(wèn)題。
【IPC分類】C12P17/02, C12R1/46
【公開號(hào)】CN105063118
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510422029
【發(fā)明人】董惠鈞, 王素珍, 李榮榮
【申請(qǐng)人】聊城大學(xué), 董惠鈞
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年7月19日