一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及沙棘活性多肽的制備，具體是一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 脫脂沙棘籽渣為沙棘提油后的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量在30%左右。目前對于沙棘 籽渣的開發(fā)利用主要集中在提取原花青素及黃酮，對沙棘籽蛋白及多肽的研究較少，尚未 見到用酶解沙棘籽制備醒酒活性肽的研究。
[0003] 醫(yī)學研究表明，長期過量飲酒或一次性大量飲酒會導致乙醇脫氫酶（ADH)活性降 低，使人體對乙醇的代謝功能下降，進而加重乙醇對腦、肝臟等器官的危害作用。近年來，隨 著保健意識的增強，解酒保健品也逐漸增多，其主要成分多為中草藥提取物。關于醒酒肽的 研究文獻包括，田田的《黑豆多肽的制備及體外醒酒活性的研究》，此研究通過酶解法制備 出一種具有醒酒作用的黑豆多肽，采用的蛋白酶為堿性蛋白酶。專利號為CN200910073036 的專利《玉米醒酒肽的制備方法》，通過復合酶解法制備出一種具有醒酒作用的多肽，所用 的酶為Alcalase堿性蛋白酶一Protamex復合蛋白酶復合水解，水解液經(jīng)粗分離、超濾、濃 縮和噴霧成型獲得玉米醒酒肽粉。專利號為CN201010540622的專利《一種醒酒肽的提取方 法》，此研究以玉米黃粉為主要原料，經(jīng)過配水、加酒精和亞硫酸鈉升溫蒸煮、過濾、濾液加 蛋白酶酶解、滅酶、脫色、膜分離，將得到的濾液經(jīng)干燥后即獲醒酒肽。但并未見到酶法制備 沙棘籽渣醒酒多肽的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法，該方法簡單，制 備的沙棘籽多肽醒酒活性更高。
[0005] 本發(fā)明提供的一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法，包括如下步驟：
[0006] 將脫脂沙棘籽渣粉碎后過60~80目篩，取篩下物按料液比1 : 10~20加水浸 泡6h以上，加入酶活為60~100萬U/g的木瓜蛋白酶水解，木瓜蛋白酶的加入量為沙棘籽 渣中蛋白質(zhì)量的1/250~1/130 ;然后經(jīng)過離心、超濾和濃縮后制得。
[0007] 木瓜蛋白酶水解條件：在pH6. 0~7. 5,溫度50~60°C條件下水解2. 5~5h。
[0008] 水解液分離條件：在5000rpm下離心10min ;然后用截斷分子量3000Da的超濾膜 進行超濾，收集濾出液做為活性多肽溶液，將該活性多肽溶液濃縮、冷藏，或噴霧干燥保存。
[0009] 體外試驗表明，該活性多肽溶液在濃度1. 5%以上時，對乙醇脫氫酶的激活作用顯 著，可以通過增強乙醇脫氫酶的活性，促進體內(nèi)乙醇的分解和代謝，達到醒酒的作用。動物 表明，該多肽具有較好的防醉酒和醒酒效果，可開發(fā)為解酒產(chǎn)品。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0011] 操作簡便，多肽得率高。木瓜蛋白酶水解沙棘籽渣得到的水解液只要通過一次離 心和一次超濾就能收集得到具有顯著提高乙醇脫氫酶激活率的活性多肽溶液。在相同多肽 含量的情況下，1. 5%的該活性多肽對乙醇脫氫酶激活率較未經(jīng)分離的水解原液提高30% 以上。
[0012] 采用本發(fā)明方法制備的分子量小于3000Da沙棘籽醒酒多肽溶液中，500Da以 下和2000-3000Da的多肽有一定的乙醇脫氫酶激活作用，但是激活率較低，分子量為 500-2000Da的多肽乙醇脫氫酶激活作用最強，同時也是所占質(zhì)量含量最大的分子段，占總 水解蛋白質(zhì)量的56%以上，可做為解酒保健食品開發(fā)利用。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1
[0014] 取50g粉碎好的脫脂沙棘籽渣（蛋白含量為26. 25% )，加入800ml蒸餾水，于常 溫下放置10小時后，調(diào)pH至6.5,加入0. 06g木瓜蛋白酶于60°C下水解2. 5h，滅酶后將酶 解液以5000r/min離心取上清液，濃縮到多肽含量達到1. 5%備用。酶解液經(jīng)微濾后，采用 瓦勒-霍赫法測定沙棘籽酶解液對乙醇脫氫酶激活率。經(jīng)測定，多肽含量為15. 8mg/mL時， 該多肽溶液對乙醇脫氫酶激活率為30.14%。經(jīng)截留分子量為3000Da的超濾膜分離得到分 子質(zhì)量Mw>3000Da和Mw〈3000Da的兩個組分，其中Mw>3000Da的組分無乙醇脫氫酶激活率， Mw〈3000Da的組分對乙醇脫氫酶激活率為57.41%，比原酶解液顯著提高。
[0015] 實施例2
[0016] 取50g粉碎好的脫脂沙棘籽渣，加入600ml蒸餾水，于常溫下放置8小時后，調(diào)pH 至7. 0,加入0. 07g木瓜蛋白酶于50°C下水解4. 5h，滅酶后將酶解液以5000r/min離心取上 清液，濃縮到多肽含量達到1. 5%。酶解液經(jīng)微濾后，選用截留分子質(zhì)量為3000Da、2000Da 和500Da的超濾膜及納濾膜，分離得到4組分，即分子質(zhì)量Mw>3000Da、Mw在2000~3000Da、 Mw在500~2000Da、Mw〈500Da。將4種分離液及原酶解液分別蒸發(fā)、濃縮到相同多肽含量 后，用瓦勒-霍赫法測定不同樣品對乙醇脫氫酶的激活率。采用凝膠色譜分析酶解液中各 段分子量的分布。實驗結果表明（表1、2)，分子量在500-2000Da沙棘籽多肽溶液具有較 好的ADH激活率，達到62. 52%，比Mw〈3000Da的混合多肽組分的乙醇脫氫酶的激活率提高 5. 11%。凝膠層析分析，該多肽溶液中分子量在500-2000Da的肽段占到56. 28%。
[0017] 表1各級酶解多肽的乙醇脫氫酶的激活率對比f S +W)
[0018]
[0019] 注：與原酶解液相比，林.P < 0. 01，差異極顯著；P < 0. 05,差異顯著。
[0020] 表2沙棘酶解產(chǎn)物的主要成分及質(zhì)量含量/%
[0021]
[0022] 實施例3
[0023] 取50g粉碎好的脫脂沙棘籽渣，加入1000ml蒸餾水，于常溫下放置10小時后，調(diào) pH至6. 0,加入0. 09g木瓜蛋白酶于55°C下水解3. 5h，滅酶后將酶解液以5000r/min離心 取上清液，濃縮到多肽含量達到1. 5%后，用截留分子質(zhì)量為3000Da的超濾膜分離純化，得 到分子量小于3000Da的沙棘籽多肽溶液，濃縮到多肽含量為4%后備用。
[0024] 防醉試驗程序為先灌多肽樣品再灌飲用濃度為56°放酒。取40只雄性小鼠（雌 雄各半），隨機分為4組：模型組；沙棘多肽低、中、高劑量（100、200、400mg/kg .bw)組。模 型組按體重灌胃0. lmL/10g劑量的生理鹽水，實驗組按體重灌胃0. lmL/10g劑量的相應提 取物溶液，30min后所有小鼠灌胃同等劑量的56°白酒。記錄各組的醉酒（翻正反射消失） 時間（以給酒后開始計時）和醒酒（翻正反射恢復）時間（以給酒后開始計時）。
[0025] 醒酒試驗也是先灌酒再灌樣品。分組方法同防醉試驗，只是將4組先灌胃 0. lmL/10g劑量的56°白酒，30min后再灌胃0. lmL/10g樣品溶液或生理鹽水。記錄4組的 醒酒（翻正反射恢復）時間（以給酒后開始計時）。
[0026] 實驗結果表明（表3、4)，沙棘多肽劑量組的醉酒時間及醒酒時間顯著低于模型 組，說明沙棘籽多肽高、中、低劑量具有明顯的防醉及醒酒作用，高劑量組的醉酒時間及醒 酒時間明顯低于低劑量組，顯示出一定的劑量依賴關系。
[0027] 表3防醉試驗
[0028]
[0029] 表4醒酒試驗
[0030]
[0031] 注：與模型組相比，P < 0. 01，差異極顯著；*. P < 0. 05,差異顯著。
【主權項】
1. 一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將脫脂沙棘 籽渣粉碎后過60~80目篩，取篩下物按料液比I : 10~20加水浸泡6h以上，加入酶 活為60~100萬U/g的木瓜蛋白酶水解，木瓜蛋白酶的加入量為沙棘籽渣中蛋白質(zhì)量的 1/250~1/130 ;然后經(jīng)過離心，超濾，收集濾出液濃縮、冷藏，或噴霧干燥保存。2. 如權利要求1所述的一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法，其特征在于，木瓜蛋 白酶水解條件為：在pH6. 0~7. 5,溫度50~60°C條件下水解2. 5~5h。3. 如權利要求1所述的一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法，其特征在于，所述的 離心條件為：在5000rpm下離心10min。4. 如權利要求1所述的一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法，其特征在于，所述的 超濾是用截斷分子量3000Da的超濾膜進行超濾。5. 如權利要求1所述的一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法，其特征在于，所述的 木瓜蛋白酶的酶活為100萬u/g。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于醒酒的沙棘籽多肽的制備方法。具體是以脫脂沙棘籽渣為原料，加入木瓜蛋白酶，在其最適條件下水解，然后通過用截留分子量為3000Da的超濾膜分離酶解液，得到分子量小于3000Da沙棘籽醒酒多肽溶液，體外試驗表明，該多肽溶液對乙醇脫氫酶具有明顯的激活作用，其中500～2000Da的多肽活性最強；該多肽可以通過增強乙醇脫氫酶的活性，促進體內(nèi)乙醇的分解和代謝，達到醒酒的作用。動物試驗表明，該多肽按體重攝入200mg/kg·bw能起到防醉酒和醒酒作用，可用做醒酒保健食品的原料。
【IPC分類】C07K1/34, C12P21/06
【公開號】CN105063139
【申請?zhí)枴緾N201510425025
【發(fā)明人】王常青, 陳彤
【申請人】山西大學
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月17日