一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法。
【背景技術】
[0002]抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)是生物體天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕木哂锌咕V廣、熱穩(wěn)定性高、安全高效等諸多優(yōu)點，食物源蛋白抗菌肽的制備成為生物領域的研究熱點之一。
[0003]豬血是生豬屠宰加工過程中的主要副產物之一，營養(yǎng)價值很高，素有“液態(tài)肉”之稱，我國豬血資源非常豐富，但利用率低，不超過10%，如被加工成血粉作為飼料添加劑，用于生化制藥中血紅素、蛋白胨的生產，這些產品附加值低，而大多數作為廢棄物直接排出，造成了資源浪費和環(huán)境污染。
[0004]歐美、日本等發(fā)達國家將豬血開發(fā)成肽類試劑、肽類藥物等多種功能食品及食品添加劑，普遍推廣，利用率達50%以上。因此，以豬血為底物開發(fā)生物活性肽，可以提高生豬屠宰加工企業(yè)產品附加值，顯示出巨大的市場前景。
[0005]研究表明，豬血中具有較強抗菌活性的多肽，因此開發(fā)研究一種從豬血中提取、純化抗菌肽的成熟方法，可以一舉多得。目前從豬血中提取抗菌肽的技術方法和產品尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0006]針對現有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種成本低、效果好的利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法。
[0007]本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的:提供一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，包括以下步驟:
(I)采集新鮮豬血，以5g / L的梓檬酸鈉抗凝，在4°C、8000r / min離心lOmin，收集下層沉淀，以獲得紅血球；在紅血球中加入同等體積的蒸餾水，超聲波細胞破碎輔助溶血20min，然后在4°C、4000r / min離心lOmin，得到血紅蛋白溶液，于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0008](2)取適量血紅蛋白溶液，加入胰蛋白酶酶解(加酶量2500-3500U / g)，攪拌，ImoI/LNaoH溶液或HCl溶液維持體系pH8.0，45_55°C，4_6h ;將酶解反應產物迅速升溫至85°C并保持此溫度10?15分鐘，再迅速冷卻至O?30°C以終止酶解反應，調節(jié)pH值至7.0左右，8000r / min離心15min，獲得上清酶解液，4°C冷藏備用。
[0009](3)活性炭用量為酶解液總重的5-30%，溫度55°C，攪拌脫色20_30min ;再進行粗濾處理后得粗濾酶解液；將粗濾酶解液在0.1?0.2Mpa的工作壓力和O?45°C的工作溫度下，采用截留分子質量為1kD超濾膜進行超濾處理，以除去大分子蛋白類物質，得超濾酶解液；再將超濾酶解液依次進行真空濃縮、冷凍干燥，得抗菌肽，_20°C保存。
[0010]以上所述的一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是:所述步驟(2)中胰蛋白酶是酶比活力10X104u/g;胰蛋白酶加酶量是3000U / go
[0011]本發(fā)明的一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，具有如下優(yōu)點:
1.本發(fā)明所制備的抗菌肽是豬血紅蛋白經生物酶水解而得，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、無殘留、無副作用、高效抗菌等特點，是一種新型的綠色抗微生物藥物。
[0012]2.采用本發(fā)明方法提取的抗菌肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、不產生耐藥性、有免疫調節(jié)作用等功能。
[0013]3.本發(fā)明所采用的原料來源廣泛，價格低廉，經過本發(fā)明的技術轉化可以有效的提高豬血副產物的附加值，對繼續(xù)促進生豬產業(yè)的發(fā)展有重要的意義。
[0014]4.本發(fā)明的產品可以作為藥品、保健食品、食品、食品添加劑、藥物增效劑等，工藝科學合理，操作簡單，具有較強的工業(yè)實施性。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
(I)采集新鮮豬血100L，以5g / L的梓檬酸鈉抗凝，在4°C、8000r / min離心lOmin，收集下層沉淀，以獲得紅血球約45L (固含30%);在紅血球中加入45L蒸餾水，超聲波細胞破碎輔助溶血20min，然后在4°C、4000r / min離心lOmin，得到血紅蛋白溶液90L。
[0016](2)取適量血紅蛋白溶液，加入410g胰蛋白酶酶解(酶比活力為10X104u/g)，攪拌，ImoI/LNaoH溶液維持體系pH8.0，50°C，5h ;將酶解反應產物迅速升溫至85°C并保持此溫度15分鐘，再迅速冷卻至O?30°C以終止酶解反應，調節(jié)pH值至7.0左右，8000r /min離心15min，獲得上清酶解液90L。
[0017](3)酶解液中加入活性炭用量15kg，溫度55°C，攪拌脫色20_30min ;再進行粗濾處理后得粗濾酶解液；將粗濾酶解液在0.1?0.2Mpa的工作壓力和O?45°C的工作溫度下，采用截留分子質量為1kD超濾膜進行超濾處理，收集超濾透過液78L ;再將超濾透過液真空濃縮至30L，進行冷凍干燥，得抗菌肽1.68 kg, -20°C保存。
[0018]檢測結果，所得抗菌肽肽含量為92.0l %，色澤白色細膩。
[0019]實施例2
(I)采集新鮮豬血50L，以5g / L的梓檬酸鈉抗凝，在4°C、8000r / min離心lOmin，收集下層沉淀，以獲得紅血球約23L (固含30%);在紅血球中加入23L蒸餾水，超聲波細胞破碎輔助溶血20min，然后在4°C、4000r / min離心lOmin，得到血紅蛋白溶液46L。
[0020](2)取適量血紅蛋白溶液，加入200g胰蛋白酶酶解(酶比活力為10X104u/g)，攪拌，ImoI/LNaoH溶液維持體系pH8.0，50°C，5h ;將酶解反應產物迅速升溫至85°C并保持此溫度15分鐘，再迅速冷卻至O?30°C以終止酶解反應，調節(jié)pH值至7.0左右，8000r /min離心15min，獲得上清酶解液46L。
[0021](3)酶解液中加入活性炭用量10kg，溫度55°C，攪拌脫色20-30min ;再進行粗濾處理后得粗濾酶解液；將粗濾酶解液在0.1?0.2Mpa的工作壓力和O?45°C的工作溫度下，采用截留分子質量為1kD超濾膜進行超濾處理，收集超濾透過液78L ;再將超濾透過液真空濃縮至30L，進行冷凍干燥，得抗菌肽0.96 kg, -20°C保存。
[0022]檢測結果，所得抗菌肽肽含量為94.41%，色澤白色細膩。
【主權項】
1.一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是包括以下步驟: (1)采集新鮮豬血，以5g/ L的梓檬酸鈉抗凝，在4°C、8000r / min離心lOmin，收集下層沉淀，以獲得紅血球；在紅血球中加入同等體積的蒸餾水，超聲波細胞破碎輔助溶血20min，然后在4°C、4000r / min離心lOmin，得到血紅蛋白溶液，于4°C保存?zhèn)溆茫? (2)取適量血紅蛋白溶液，加入一定量的胰蛋白酶酶解，攪拌，ImoI/LNaoH溶液維持體系pH8.0，45-55°C，4-6h ;將酶解反應產物迅速升溫至85°C并保持此溫度10?15分鐘，再迅速冷卻至O?30°C以終止酶解反應，調節(jié)pH值至7.0左右，8000r / min離心15min，獲得上清酶解液，4°C冷藏備用； (3)活性炭用量為酶解液總重的5-30%，溫度55°C，攪拌脫色20-30min;再進行粗濾處理后得粗濾酶解液；將粗濾酶解液在0.1?0.2Mpa的工作壓力和O?45°C的工作溫度下，采用截留分子質量為1kD超濾膜進行超濾處理，以除去大分子蛋白類物質，得超濾酶解液；再將超濾酶解液依次進行真空濃縮、冷凍干燥，得抗菌肽，_20°C保存。2.根據權利要求1所述的一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是:所述步驟(2)中胰蛋白酶是酶比活力10X104u/g。3.根據權利要求1所述的一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是:所述步驟(2)中胰蛋白酶加酶量是3000U / go
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，包括以下步驟：將豬全血分離得豬血球，再將豬血球溶血、酶解、脫色、超濾、真空濃縮、凍干，即得抗菌肽；所述胰蛋白酶的加酶量是3000U／g，在pH8、溫度45℃～55℃條件下，酶解反應時間4～6h。本發(fā)明的利用豬血紅蛋白制取抗菌肽的方法，成本低、效果好。
【IPC分類】C07K1/34, C12P21/06
【公開號】CN105063144
【申請?zhí)枴緾N201510497498
【發(fā)明人】寧成勇, 寧發(fā)子, 寧成剛
【申請人】重慶都好生物科技有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月14日