0034] (3)用6L70%的乙醇溶液洗脫上述打孔樹脂柱，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏 狀，得海參浸膏；
[0035] (4)用500mL的去離子水復(fù)溶上述海參浸膏，8000r/min離心40min取上清，上清 液經(jīng)石油醚萃取脫脂，取水層再用水飽和正丁醇萃取三次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏 狀，冷凍干燥即得海參提取物約I. 5g;
[0036] (5)采用HPLC對(duì)海參提取物進(jìn)行檢測(cè)，在25°C用水（A)-乙腈⑶進(jìn)行梯度洗 脫，洗脫流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，洗脫條件見表1，結(jié)果見圖1。而后將海參提 取物I. 5g用甲醇溶解，采用中高壓制備液相色譜儀，色譜柱C18 (4. 6X250mm，5ym)，檢測(cè) 波長(zhǎng)203nm，柱溫25°C，流速為lmL/min，流動(dòng)相為水（A)-乙腈（B)，洗脫程序如前，收集 15. 33min的洗脫峰，制備出6-0H刺桐堿純品20mg(HPLC圖譜如圖2所示）。
[0037] 表IHPLC流動(dòng)相配比
[0038]
[0039] 上述制得的6-0H刺桐堿分子式為C14H18N2O3,其結(jié)構(gòu)式如下：
[0040]
[0041] 從刺參分離出的6-0H刺桐堿為白色無定形粉末。1H和13C核磁共振數(shù)據(jù)見表2。
[0042] 表2 6-0H刺桐堿的1H和13C核磁共振數(shù)據(jù)
[0043]
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 對(duì)實(shí)施例1制備的6-0H刺桐堿進(jìn)行體外抗腫瘤試驗(yàn)，表明其具有中等強(qiáng)度的抗腫 瘤作用。試驗(yàn)所用細(xì)胞株為國(guó)際通用的腫瘤細(xì)胞株，即：肺癌細(xì)胞A_549、NCI_H1299,肝癌 細(xì)胞H印G2,前列腺癌細(xì)胞PC-3和乳腺癌細(xì)胞MCF-7。
[0046] 6-OH刺桐堿用DMSO配成標(biāo)準(zhǔn)濃度50 y g/mL，用0. 45 y L的微孔濾膜過濾，使用時(shí) 依次倍比稀釋為25,12. 5,6. 25和3. 125 y g/mL加入到待測(cè)細(xì)胞中?？鼓[瘤活性的測(cè)定采 用MTT法：
[0047] a)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞以I X IO5AiL的濃度接種于96孔板，100 y 1/孔， 于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁；
[0048] b)吸去上清液，加入含實(shí)驗(yàn)所需濃度樣品液的維持液，于37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)48h ;
[0049] c)棄藥液，每孔加含5mg/mL的MTT20 y 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h ;
[0050] d)終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加DMSO 150 y 1/孔，置于搖床上震蕩lOmin，使結(jié)晶 充分溶解，于酶標(biāo)儀570nm處測(cè)各孔吸光值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基，MTT，DMSO)，對(duì) 照孔（細(xì)胞，相同濃度的藥物溶解介質(zhì)DMSO,培養(yǎng)液，MTT，DMSO)
[0051 ] e)計(jì)算：細(xì)胞抑制率=[(對(duì)照-本底）-(給藥-本底）V (對(duì)照-本底）X 100 %， 試驗(yàn)結(jié)果見圖3和下表3:
[0052] 表3 6-0H刺桐堿對(duì)各種癌細(xì)胞抑制作用的1(：50值
[0053]
[0054] 注：" / " 表示 IC5。值超過 50 y g/mL
[0055] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-OH刺桐堿對(duì)肺癌細(xì)胞A-549、NCI-H1299,前列腺癌細(xì)胞 PC-3和乳腺癌細(xì)胞均顯示明顯抑制作用，而對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2的抑制作用較弱。本發(fā)明為 研制新的抗腫瘤藥物提供基礎(chǔ)，對(duì)開發(fā)海洋藥物具有重要價(jià)值。
[0056] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即 依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海參生物堿，其特征在于：為6-0H刺桐堿，其分子式為C14H1SN203，其結(jié)構(gòu)式如 下：2. -種權(quán)利要求1所述的海參生物堿的制備方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 將新鮮海參去除內(nèi)臟后，放入沸水中煮20~40min，撈出海參，得海參水煮液； (2) 將海參水煮液調(diào)pH為10~11，離心取上清，將上清液上樣于大孔吸附樹脂柱，吸 附飽和后，分別用去離子水和17~23%乙醇溶液洗柱； (3) 用70~75 %乙醇溶液沖洗上述大孔樹脂柱，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，得海 參浸膏； (4) 將海參浸膏用去離子水復(fù)溶后，離心取上清，上清液經(jīng)石油醚萃取取水層，再用水 飽和正丁醇萃取，合并正丁醇層，再減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得海參提取物； (5) 將海參提取物經(jīng)中高壓制備液相色譜儀，用乙腈-水洗脫體系進(jìn)行洗脫，203nm處 紫外檢測(cè)，對(duì)15. 34min的峰進(jìn)行收集，冷凍干燥即得所述海參生物堿，乙腈-水洗脫體系 為：0~3min采用10%乙腈洗脫，3~33min用10 %~100 %的乙腈進(jìn)行梯度洗脫，33~ 43min用100%乙腈洗脫。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述海參為刺參。4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟⑴為：將新鮮海參去除內(nèi)臟 后，放入沸水中煮20~30min，撈出海參，得海參水煮液。5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟⑵為：將海參水煮液調(diào)pH 為10,離心取上清，將上清液上樣于大孔吸附樹脂柱，吸附飽和后，分別用去離子水和20% 乙醇溶液洗柱。6. 如權(quán)利要求2或5所述的制備方法，其特征在于：所述打孔吸附樹脂的型號(hào)為AB-8。7. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)為：用70%乙醇溶液沖洗 上述大孔樹脂柱，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，得海參浸膏。8. -種權(quán)利要求1所述的海參生物堿在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海參生物堿及其制備方法和應(yīng)用，該海參生物堿為6-OH刺桐堿，其分子式為C14H18N2O3，其結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明制備的海參生物堿對(duì)肺癌細(xì)胞A-549、NCI-H1299，前列腺癌細(xì)胞PC-3和乳腺癌細(xì)胞均顯示明顯抑制作用，而對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用較弱，為研制新的抗腫瘤藥物提供基礎(chǔ)，對(duì)開發(fā)海洋藥物具有重要價(jià)值。
【IPC分類】C07D209/20, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105085368
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510196415
【發(fā)明人】林毅, 林淑芳
【申請(qǐng)人】華僑大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年4月23日