因序列設(shè)計PCR擴增引物，擴增提取URA3基因序列；
[0058] 根據(jù)提取的URA3基因序列⑶S上下游分別設(shè)計引物，進行PCR擴增得到URA3基 因序列CDS上游片段和下游片段；將上游片段和下游片段與線性化載體片段克隆連接，獲 得URA3基因缺失突變質(zhì)粒；
[0059] URA3基因缺失突變質(zhì)粒為模板擴增得到URA3基因缺失突變表達框線性DNA片 段，將該片段轉(zhuǎn)化馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621菌株，得到敲除部或部分URA3基因 的馬克思克魯維酵母菌F頂-1 (ura3 A)〇
[0060] 在第一種優(yōu)選實施例中，根據(jù)URA3基因序列⑶S上下游設(shè)計引物的方法包括： URA3基因序列⑶S上游、下游片段的5'和3'末端添加10-25bp的同源序列。更優(yōu)選地， URA3基因序列⑶S上游片段5'端和線性化載體片段的3'末端添加10-25bp的同源序列； URA3基因序列⑶S下游片段3'端和線性化載體片段的5'末端添加10-25bp的同源序列。
[0061] 更優(yōu)選為根據(jù)URA3基因序列⑶S上下游設(shè)計的引物為：
[0062]URA上游F :
[0063] 5' -GATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3 '
[0064]URA3上游R :5 '-CGAGTACACTTAGAAGCGTATTGTGATGAGCATCC-3'
[0065]URA3下游F :5 '-TACGCTTCTAAGTGTACTCGGATCAGAAGTTACAAG-3'
[0066]URA3下游R :
[0067] 5' -GACGATATCTCTAGAGGATCCCCCAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3'
[0068] 在第一種優(yōu)選實施例中，根據(jù)URA3基因序列設(shè)計PCR擴增引物優(yōu)選為：
[0069] URA3F :5' -CCCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3'
[0070] URA3R :5' -CAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3'
[0071] 在第一種優(yōu)選實施例中，所述線性化載體片段優(yōu)選為PMD-18T空載質(zhì)粒酶切厚的 線性化載體片段，所述酶切優(yōu)選為PstI、Smal雙酶切。
[0072] 在第二種優(yōu)選實施例中，本發(fā)明敲除馬克思克魯維酵母菌F頂-l(ura3 A)的全部 或部分HIS3基因，得到在SC-Histidine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長的馬克思克魯維酵母 菌FIM-2 (ura3 A his3 A)0
[0073]即第一基因為URA3基因、第二基因為HIS3基因；其中，優(yōu)選地，第二基因上游序列 為SEQIDNo. 18、第一下游序列為SEQIDNo. 19、第二下游序列為SEQIDNo. 21，第一基因 標(biāo)簽基因序列為SEQIDNo. 20。
[0074] 其中，敲除全部或部分HIS3基因的步驟包括：
[0075] 根據(jù)HIS3基因序列設(shè)計PCR擴增引物，擴增得到如下同源序列：HIS3基因序列上 游序列SEQIDNo. 18、下游序列SEQIDNo. 19和SEQIDNo. 21，擴增URA3標(biāo)簽基因序列 SEQIDNo. 20 ；
[0076]擴增所得SEQIDNo. 18、SEQIDNo. 19、SEQIDNo. 20、SEQIDNo. 21 序列片段 與線性化載體DNA序列克隆連接，得到HIS3基因缺失突變質(zhì)粒；
[0077] 酶切HIS3基因缺失突變質(zhì)粒得到HIS3基因缺失突變表達框，轉(zhuǎn)化 F頂-1 (ura3A)菌株，得到敲除部或部分URA3基因、HIS3基因的馬克思克魯維酵母菌 FIM-2 (ura3Ahis3A) 0
[0078] 在第二種優(yōu)選實施例中，設(shè)計PCR擴增引物時，分別在SEQIDNo. 18、SEQID No. 19、SEQIDNo. 20、SEQIDNo. 21片段5'和3'末端添加10-25bp的同源序列。其中更 優(yōu)選為：SEQIDNo. 19片段3'和SEQIDNo. 21片段5'末端包含10-25bp同源序列，其中 SEQIDNo. 20片段5'和SEQIDNo. 19片段3'末端包含10-25bp同源序列，其中SEQID No. 19片段5'和線性化載體3'末端包含10-25bp同源序列，其中線性化載體5'和SEQID No. 21片段3'末端包含10-25bp同源序列。
[0079] 更優(yōu)選為所述PCR擴增引物為：
[0080] SEQIDNo. 18F：
[0081] 5 ' -GATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCATTCGGTGGCAAACCTCTATAAACGC-3 '
[0082] SEQIDNo. 18R：
[0083] AGAAATGTGGCCCGGGAGGACCAACCAGAGTGCTTCGCTAGGG-3，
[0084] SEQIDNo. 19F：
[0085] 5 ' -GATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCACATTTCTTGGAGTCATTTGCGG-3 '
[0086] SEQIDNo. 19R：
[0087] 5' -TCCAATCAGAATTCGAGCTTCCCTAATCGAACCAAAGAATG-3，
[0088] SEQIDNo. 20F：
[0089] 5, -TCGATTAGGGAAGCTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATTCTGC-3'
[0090]SEQIDNo.20R：
[0091] 5 ' -GACGATATCTCTAGAGGATCCCCTCCGAGTACACTCGAACCTCTGCTTGTTC-3 '
[0092] SEQIDNo. 2IF：
[0093] 5' -GGTTGGTCCTCCCGGGACCACATTTCTTGGAGTCATTTGCGG-3'
[0094]SEQIDNo. 21R：
[0095] 5' -GACGATATCTCTAGAGGATCCCCGTTGAAAGCGGAACTGTAACCCTTGC-3'
[0096] 在第二種優(yōu)選實施例中，所述線性化載體DNA片段優(yōu)選為pMD-18T空載質(zhì)粒雙酶 切后所得線性化載體片段。所述雙酶切優(yōu)選為PstI、Smal雙酶切。
[0097] 在第二種優(yōu)選實施例中，構(gòu)建HIS3基因缺失突變質(zhì)粒的方法包括：
[0098] 利用所述同原序列，將SEQIDNo. 18、SEQIDNo. 21克隆連接到所述線性化載體 DNA片段，然后單酶切獲得包含SEQIDNo. 18、SEQIDNo. 21序列的線性化載體I;
[0099] 將SEQIDNo. 19、SEQIDNo. 20克隆連接到所述線性化載體DNA片段，得到連接 質(zhì)粒，擴增所述連接質(zhì)粒，獲得SEQIDNo. 19-SEQIDNo. 20連接的DNA片段；利用同源序 列，將所述SEQIDNo. 19-SEQIDNo. 20連接的DNA片段與線性化載體I克隆連接，得到 HIS3基因缺失突變質(zhì)粒。
[0100] 在第三種優(yōu)選實施例中，本發(fā)明敲除馬克思克魯維酵母菌F頂-l(ura3A)和/或 F頂-2 (ura3Ahis3A)的全部或部分ADE2基因，得到在SC-Adenine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能 生長的馬克思克魯維酵母菌。
[0101] 即，第一基因為URA3基因、HIS3基因中的任意一種或幾種；第二基因為ADE2基 因；其中，優(yōu)選地，第二基因上游序列為SEQIDNo. 22、第一下游序列為SEQIDNo. 23、第二 下游序列為SEQIDNo. 24,第一基因標(biāo)簽基因序列為SEQIDNo. 20。
[0102] 在第三種優(yōu)選實施例中，敲除馬克思克魯維酵母菌F頂-l(ura3A)的全部或部分 ADE2基因的方法包括：
[0103] 克隆ADE2基因序列，用K.laticsKLLA0E02685g基因序列進行BLAST獲得三段同 源序列SEQIDNo. 22-SEQIDNo. 24 ;根據(jù)所得同源序列、以及SEQIDNo. 20設(shè)計引物，擴 增所述同源序列和SEQIDNo. 20 ;
[0104] 擴增后的同源序列、以及SEQIDNo.20序列與線性化載體DNA片段克隆連接，得 到ADE2基因缺失突變質(zhì)粒；
[0105] 酶切獲得ADE2基因缺失突變表達框，轉(zhuǎn)化F頂-l(ura3A)得到敲除部或部 分URA3基因、ADE2基因的馬克思克魯維酵母菌F頂-4 (ura3Aade2A);和/或轉(zhuǎn)化 F頂-2 (ura3Ahis3A)，得到敲除部或部分URA3基因、HIS3基因、ADE2基因的馬克思克魯維 酵母菌FIM-5 (ura3Ahis3Aade2A)0
[0106] 在第三種優(yōu)選實施例中，根據(jù)所得同源序列設(shè)計引物時，優(yōu)選為：分別在SEQID No. 22、SEQIDNo. 23、SEQIDNo. 24、SEQIDNo. 20 片段 5' 和 3' 末端添加 10-25bp同源 序列。更優(yōu)選為：SEQIDNo. 22片段3'和SEQIDNo. 23片段5'末端包含10-25bp同源 序列，SEQIDNo. 20片段3'和SEQIDNo. 24片段5'末端包含10-25bp同源序列，SEQID No. 22片段5'和線性化載體DNA序列3'末端包含10-25bp同源序列，線性化載體DNA序列 5'和SEQIDNo. 24片段3'末端包含10-25bp同源序列。更優(yōu)選地，所述引物為：
[0107] SEQIDNo. 20F：
[0108] 5' -ATCGTCCAAACGAATTCTGATTGGAAAGACCATTC-3'
[0109] SEQIDNo. 20R：
[0110] 5 ' -ATAGGCAAATAGGTCCGAGTACACTCGAACCTCTGCTTG-3 '
[0111] SEQIDNo. 22F：
[0112] 5 ' -CGAATTCGAGCTCGGTACCCGGATCCGATAGTGGAGGCCGCTCACAGATTG-3 '
[0113] SEQIDNo. 22R：
[0114] 5 ' -CCTAGAACATCTCTACACCGAAAATACC-3 '
[0115] SEQIDNo. 23F：
[0116] 5 ' -GAGATGTTCTAGGATTTGCCTATGCCAAAAGAATTCAC-3 '
[0117] SEQIDNo. 23R：
[0118]5 ' -TCAGAATTCGTTTGGACGATAGAATGCAAAGAATC-3 '
[0119]SEQIDNo. 24F：
[0120] 5' -CCTATTTGCCTATGCCAAAAGAATTCAC-3'