r>[0121] SEQIDNo. 24R：
[0122] 5 ' -CAGTGCCAAGCTTGCATGCCGGATCCGAATTCTAATAGCTAGTAAAGCAGC-3 '
[0123] 在第三種優(yōu)選實施例中，所述線性化載體DNA片段優(yōu)選為pMD-18T空載質粒雙酶 切后所得線性化載體片段。所述雙酶切優(yōu)選為PstI、Smal雙酶切。
[0124] 在第三種優(yōu)選實施例中，構建ADE2基因缺失突變質粒的方法包括：
[0125] 利用所述同源序列，將SEQIDNo. 22、SEQIDNo. 24克隆連接，獲得SEQID No. 22-SEQIDNo. 24 的DNA片段；
[0126]將SEQIDNo. 23、SEQIDNo. 20 克隆連接，獲得SEQIDNo. 20-SEQIDNo. 23 連 接的DNA片段；
[0127]利用同源序列，將所述SEQIDNo. 22-SEQIDNo. 24 的DNA片段、SEQID No. 20-SEQIDNo. 23連接的DNA片段與所述線性化載體DNA序列克隆連接，得到ADE2基因 缺失突變質粒。
[0128] 在第四種優(yōu)選實施例中，本發(fā)明敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621的全部 或部分HIS3基因，得到在SC-Histidine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長的馬克思克魯維酵母 菌F頂-3(his3A)。
[0129] 在第四種優(yōu)選實施例中，敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621的全部或部分 HIS3基因方法優(yōu)選為包括：
[0130] 克隆URA3基因，并針對URA3基因設計PCR擴增引物，擴增獲得包含URA30RF的 DNA片段；
[0131] 所述包含1]狀301^的0嫩片段轉化？頂-2(1^13八1^83八）菌株，通過同源重組回 補URA3,獲得敲除全部或部分HIS3基因的馬克思克魯維酵母菌F頂-3 (his3A)。
[0132] 在第四種優(yōu)選實施例中，本發(fā)明敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621的全 部或部分HIS3基因和全部或部分ADE2基因，得到在SC-Histidine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、以及 SC-Adenine營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中不能生長的馬克思克魯維酵母菌F頂-6 (his3Aade2A)。
[0133] 在第五種優(yōu)選實施例中，敲除馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621的全部或部分 HIS3基因和全部或部分ADE2基因的方法優(yōu)選為包括：
[0134] 克隆URA3基因，并針對URA3基因設計PCR擴增引物，擴增獲得包含URA30RF的 DNA片段；
[0135] 所述包含URA30RF的DNA片段轉化F頂-5 (ura3Ahis3Aade2A)菌株，通過同源 重組回補URA3,獲得敲除全部或部分HIS3基因、和全部或部分ADE2基因的馬克思克魯維酵 母菌FIM-6(his3Aade2A)。
[0136] 其中，上述的針對URA3基因設計的PCR擴增引物優(yōu)選為：
[0137]URA3-F: 5 ' -CCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3 '
[0138]URA3-R: 5 ' -CAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3 '
[0139] 其中，CGMCCNo. 10621保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心； 保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期為 2015年3月13日，分類命名為：馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus)。
[0140] 本發(fā)明上述內容中，本發(fā)明上述內容中，術語ura3、URA3、Ura3具有相同的含義； 術語his3、HIS3、His3具有相同的含義；術語ade2、ADE2、Ade2具有相同的含義。
[0141] 本發(fā)明上述內容中，沒有特別說明的情況下，URA3基因、HIS3基因、ADE2基因均指 的是馬克思克魯維酵母菌的基因。
[0142]CGMCCNo. 10621相比于ATCC8585、ATCC26548等現(xiàn)有克魯維酵母，具有更高的分 泌蛋白的能力和更高的生物量、以及發(fā)酵時間短等特征。本發(fā)明方法所構建的營養(yǎng)缺陷型 馬克思克魯維酵母菌株，可以用于馬克思克魯維酵母表達系統(tǒng)的宿主菌，用于重組制備外 源蛋白（酶）。另外，本發(fā)明提供的優(yōu)選的第二基因敲除方法，標簽基因序列能夠回收利用。
【附圖說明】
[0143] 圖1為實施例1中pMD-18Tura3A-cas質粒構建示意圖；
[0144] 圖2為實施例1中同源重組方法敲除F頂基因組上的URA3基因示意圖；
[0145] 圖3為實施例1中所得F頂-1 (ura3A)與野生型F頂在尿嘧啶營養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基 上的生長狀態(tài)；
[0146] 圖4為實施例2中構建的pMD-18This3A-cas質粒所用各DNA片段凝膠電泳圖；
[0147]其中 1 :HIS3up607bp片段；2 :HIS3dowl565bp片段；3、5:KmURA3 ;4: HIS3dow2604bp片段；7 :pMD-18T質粒Smal單酶切的線性化片段；
[0148]圖5為實施例2中pMD-18This3A-ca質粒構建示意圖；
[0149] 圖6為實施例2中F頂-2 (ura3Ahis3A)菌株構建原理示意圖；
[0150] 圖7為實施例2中F頂-2 (ura3Ahis3A)菌株構建篩選過程結果；
[0151] 圖8為實施例3中pMD-18Tade2AURA3質粒構建所用各DNA片段凝膠電泳 圖；其中，1 :ADE2 基因DNA片段，1710bp;2 :ADE2_up片段，722bp;3 :ADE2dow2 片段， 693bp;4 :ADE2dowl片段，617bp;5 :KmURA3 片段，1430bp;6 :ADE2up-ADE2dowl片段；7: URA3-ADE2dow2 片段；8 :pMD18T-(ADE2up+ADE2dowl)質粒；9 :pMD18T-(URA3+ADE2dow2)質 粒；10 :pMD18T-(ADE2up+ADE2dowl)質粒Spel單酶切片段；11 :pMD-18Tade2AURA3 質粒； 12 :pMD-18Tade2AURA3 質粒Kpnl、Sphl雙酶切片段；
[0152] 圖9為實施例3中pMD-18Tade2AURA3質粒構建示意圖；
[0153] 圖10為實施例3中F頂-4 (ura3Aade2A)菌株平板鑒定結果；
[0154] 圖11為實施例3中F頂-5 (ura3Ahis3Aade2A)菌株平板鑒定結果；
[0155] 圖12為實施例4中F頂-3 (his3A)菌株平板鑒定結果。
【具體實施方式】
[0156] 本發(fā)明下述實施例中所用馬克思克魯維酵母CGMCCNo. 10621篩選方法：
[0157] 2014年8月從西藏那曲地區(qū)采集不同的酸奶樣本。
[0158] 取酸奶樣本用無菌水進行，涂布于酵母固體培養(yǎng)基YNB(無氨基酵母氮源；Yeast NitrogenBasewithoutAminoAcids)+1 %菊粉平板上，30°C培養(yǎng)形成克隆。
[0159] 將酸奶樣本中分離到的酵母菌在含1 %酵母提取物（YeastExtract)和2%的葡 萄糖液體培養(yǎng)基中，30°C發(fā)酵培養(yǎng)后離心收集發(fā)酵上清，檢測各株酵母分泌蛋白的能力。其 中發(fā)現(xiàn)：一株酵母FIM-1具有高分泌蛋白能力，分泌蛋白的大小約90kDa左右。
[0160] 酵母菌F頂-1的菌種的鑒定：
[0161] 進行PCR擴增與測序，發(fā)現(xiàn)獲得的酵母菌F頂-1的18srDNA序列（SEQIDNo. 1) 與GenBank中的已知K.marxianusNBRC1777的序列相似度為100%。
[0162] 細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，酵母菌F頂-1的株菌落為圓形，呈乳白色，邊緣整齊，顯微 下觀察發(fā)現(xiàn)該酵母菌呈橢圓形，大小約為4-8ym，出芽生殖，單個、兩個或多個系成串粘 連，這些表現(xiàn)與馬克斯克魯維酵母的細胞形態(tài)基本一致，因此該酵母菌命名為K.marxianus FIM-l〇
[0163] 本發(fā)明所述的馬克思克魯維酵母菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所， 保藏日期為2015年3月13日，保藏號為CGMCCNo. 10621。
[0164]高牛物量發(fā)酵實驗
[0165] 1)初始培養(yǎng)基：酵母粉40g，葡萄糖50g，初始體積1L。滅菌。
[0166] 2)發(fā)酵過程控制：pH7.0,用30 %氨水調節(jié)，和10%HCL調節(jié)；溶解氧設定30% D0T，依靠轉速調節(jié)溶解氧。
[0167] 3)培養(yǎng)基流加：開始流加培養(yǎng)基時間是6-10小時，殘?zhí)菨舛燃s為5_15g/L。
[0168] 4)發(fā)酵培養(yǎng)時間：30-35小時。
[0169] 5)培養(yǎng)溫度：28_35。(：。
[0170] 實驗結果：
[0171] 1)按照C:N= 5:1的規(guī)律，配制流加培養(yǎng)基，葡萄糖濃度50%，酵母粉濃度40% ; 經過35小時培養(yǎng)，消耗葡萄糖總量350克，消耗酵母粉總量280克，細胞生物量達到 99. 19g/L(干重），細胞產率最為0. 62,細胞最大生長速度為2. 92g/L。
[0172] 2)按照C:N= 5:1的規(guī)律，配制流加培養(yǎng)基，葡萄糖濃度50%，酵母粉濃度40% ; 培養(yǎng)8小時后開始流加培養(yǎng)基，培養(yǎng)34小時，消耗葡萄糖總量760克，消耗酵母粉總量440 克，細胞生物量達到117. 78g/L(干重），細胞產率為0. 56,細胞最大生長速度為3. 29g/L。
[0173] 實施例1，敲除ura3基因的馬克斯克魯維酵母工程菌株F頂-1 (ura3A)的構建
[0174] 1、版11狀3基_克降和DMD-18Tura3A-Cas質粒構律
[0175] 通過NCBI數(shù)據庫檢索獲得K.marxianus的URA3基因序列信息，并設計合成如下 引物：
[0176] URA3F: 5 ' -CCCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3 '
[0177]URA3R: 5 ' -CAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3 '
[0178] 以F頂基因組為模板，擴增含有URA3基因序列共3123bp(Chromosomel: 1541868-1544992, 3123bp)。PCR產物克隆到pMD-18T載體上，轉化感受態(tài)E.coil，通過氨芐 抗性篩選，獲得陽性克隆，并抽提質粒DNA，進行測序分析，獲得FMURA3基因序列3123bp。
[0179] 參照圖1，在1]狀30)5(0^〇111〇8〇11161:1543214-1544017