一種產(chǎn)多種氨基酸的廣東棒狀桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能產(chǎn)多種氨基酸的細(xì)菌新物種一廣東 棒狀桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 氨基酸是構(gòu)成生物蛋白質(zhì)的基本單位，有著不可替代的生物學(xué)功能，已經(jīng)被廣泛 應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品、飼料、肥料、化妝品等領(lǐng)域。谷氨酸鈉是人類應(yīng)用的第一個(gè)氨基酸， 也是世界上應(yīng)用范圍最廣、產(chǎn)銷量最大的一種氨基酸。近年來國際上醫(yī)藥、食品、飼料等行 業(yè)發(fā)展迅速，對(duì)氨基酸的需求越來越大。我國目前氨基酸生產(chǎn)企業(yè)已達(dá)近百家，總產(chǎn)量超過 300萬噸，其中，大宗氨基酸產(chǎn)品谷氨酸及其鹽類的年產(chǎn)量達(dá)220萬噸，成為氨基酸產(chǎn)品名 副其實(shí)的"世界工廠"。微生物發(fā)酵是生產(chǎn)氨基酸的重要途徑。1940年開始采用發(fā)酵法生 產(chǎn)氨基酸，1957年日本用細(xì)菌發(fā)酵進(jìn)行商業(yè)性生產(chǎn)谷氨酸（味精），目前世界上可用發(fā)酵法 生產(chǎn)的氨基酸有20多種。隨著現(xiàn)代生物工程技術(shù)的發(fā)展，利用DNA重組工程菌生產(chǎn)氨基酸 日趨增多，獲益增大。我國氨基酸生產(chǎn)技術(shù)總體水平距國際先進(jìn)水平較大，尤其表現(xiàn)在菌種 產(chǎn)酸率低，生產(chǎn)效益差，高質(zhì)量、高價(jià)值的氨基酸少等方面。因此，積極發(fā)掘產(chǎn)氨基酸的微生 物優(yōu)質(zhì)新資源，重組具特殊優(yōu)良性能的氨基酸生產(chǎn)菌種對(duì)于推動(dòng)整個(gè)氨基酸應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā) 展能夠起到極為重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能夠產(chǎn)多種氨基酸的細(xì)菌新物種一一廣東棒狀 桿菌（Corynebacteriumguangdongensis)S01，該菌株于2015年7月31日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo:11162。
[0004] 本發(fā)明的廣東棒狀桿菌（Corynebacteriumguangdongensis)S01能產(chǎn)天冬氨酸、 蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙 氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸等15種氨基酸。
[0005] 因此，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供廣東棒狀桿菌（Corynebacterium guangdongensis)S01在制備天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋 氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的廣東棒狀桿菌（Corynebacteriumguangdongensis)S01能產(chǎn)天冬氨酸、 蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙 氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸等15種氨基酸。因此，本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01在開發(fā)氨 基酸類產(chǎn)品中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0007]本發(fā)明的廣東棒狀桿菌（Corynebacteriumguangdongensis)S01 于 2015 年 7 月 31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：中國北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo: 11162。
【附圖說明】：
[0008]圖1為本發(fā)明的廣東棒狀桿菌SOI的透射電子顯微鏡照片；
[0009] 圖2為本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01的16SrRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】：
[0010] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0011] 實(shí)施例1 :
[0012] 一、廣東棒狀桿菌S01的分離。
[0013] 本發(fā)明的廣東棒狀桿菌（Corynebacteriumguangdongensis)S01分離自廣東省微 生物研究所實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)的實(shí)驗(yàn)室污染的NA平板上，NA平板在放置過程中出現(xiàn)了污染的 淺黃色菌落，挑取培養(yǎng)和鑒定淺黃色菌落過程中獲得了本發(fā)明所述的廣東棒狀桿菌S01。
[0014] 所述的NA培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g， 雙蒸水1000mL，pH7. 3,混合均勾后，滅菌備用。
[0015] 二、廣東棒狀桿菌S01的鑒定。
[0016] 1.表型特征：將廣東棒狀桿菌S01采用三區(qū)劃線接種于NA培養(yǎng)基上，置于30°C培 養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，取出觀察菌落特征。細(xì)胞形態(tài)觀察（圖1)、革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、接觸 酶、氧化酶、脲酶、硝酸鹽還原、水解七葉靈、糖類的發(fā)酵等測定參見《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》。 廣東棒狀桿菌S01對(duì)不同碳氮源的利用則采用了BiologGNIII，操作按照說明書進(jìn)行。
[0017] 培養(yǎng)基生長測試采用接種單菌落三區(qū)劃線方式，分別采用了NA、LB、R2A、TSA、 2216E培養(yǎng)基。
[0018] NA培養(yǎng)基：蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂15. 0g，雙蒸水1000mL， pH7. 3,混合均勻后，滅菌備用。
[0019]LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白酶10. 0g，酵母提取物5. 0g，氯化鈉10. 0g，瓊脂15. 0g，雙 蒸水1000mL，pH7. 0,混合均勾后，滅菌備用。
[0020] R2A培養(yǎng)基配方：酵母提取物0. 5g,蛋白胨0. 5g,酸水解干酪素0. 5g,葡萄糖 〇. 5g，可溶性淀粉 0. 5g，K2HP040 . 3g，MgS04*7H20 0.05g，丙酮酸鈉 0. 3g，瓊脂粉 15g，雙蒸 水1000mL，pH7. 0~7. 4,混合均勾后，滅菌備用。
[0021] TSA培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨15. 0g、大豆蛋白胨5. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂粉15. 0g， 雙蒸水l〇〇〇mL，pH值7. 3,混合均勾后，滅菌備用。
[0022] 2216E培養(yǎng)基配方采用青島海博產(chǎn)品（貨號(hào)：HB0132)，混合均勻后，滅菌備用。
[0023] 形態(tài)特征：廣東棒狀桿菌S01在NA平板上30°C培養(yǎng)48h后菌落呈淡黃色，圓形， 邊緣規(guī)則，表面光滑，半透明。細(xì)胞呈桿狀，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，無芽孢，兼性好氧生長（圖1)。
[0024] 生理生化特征：革蘭氏染色陽性，氧化酶陰性，接觸酶、硝酸鹽還原和脲酶為陽性， 葡萄糖、核糖、麥芽糖、乳糖和棉籽糖的發(fā)酵產(chǎn)酸均為陰性。不能水解明膠和七葉靈，能夠在 NA、LB、R2A、TSA和2216E培養(yǎng)基上生長。
[0025] 將本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01與其同源性最高的已發(fā)表模式菌株進(jìn)行了生理生 化特征的比較，結(jié)果如表1所示。
[0026] 表1廣東棒狀桿菌S01與其相關(guān)的模式菌株微生物學(xué)特性比較
[0027]
[0028]
[0029]
[0030] 注：" + "表示陽性；表示陰性；"w"表示弱陽性。
[0031] 2.遺傳發(fā)育分析：采用細(xì)菌通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和 1492R(5' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行廣東棒狀桿菌S01 的 16SrRNA基因的PCR擴(kuò) 增，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，獲得其序列信息（其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所 示），將序列信息與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)，得到與其相似度最高的已發(fā)表模式種信 息。采用生物學(xué)軟件MEGA5構(gòu)建廣東棒狀桿菌S01的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。
[0032] 16SrRNA基因擴(kuò)增和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的廣東棒狀桿菌（Corynebacterium guangdongensis)SOI最大相似度模式菌株為Corynebacteriumhumireducens MFC-5T(95.9% )，小于國際上公認(rèn)的新種臨界值97%。進(jìn)一步的遺傳發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)該 菌株屬于棒狀桿菌屬（Corynebacterium)，在進(jìn)化樹上與CorynebacteriummarisJCM 170181 (94. 8% )和CorynebacteriumdoosanenseJCM173171 (95.0%)形成穩(wěn)定的分支， 具有最近的親緣關(guān)系（圖2)。這些證據(jù)表明廣東棒狀桿菌SOI可能為棒狀桿菌屬的一個(gè)新 物種。
[0033] 3.化學(xué)分類特征：脂肪酸提取和測定采用MIDI公司的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 (Sasser, 1990)。DNAG+C含量的測定方法參照Mesbahetal. (1989)。
[0034] 將本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01與其親緣關(guān)系最近的已發(fā)表模式種進(jìn)行了脂肪酸 組成成分的比較，結(jié)果如表2所示。廣東棒狀桿菌S01在主要的脂肪酸含量上（Cls:1c〇9c， C16:。和10-methylC1S:。）與相關(guān)的模式菌株存在明顯的差異，表明廣東棒狀桿菌S01是區(qū)別 于已發(fā)表的相關(guān)模式菌種，可能為棒狀桿菌屬的一個(gè)新物種。
[0035] 表2廣東棒狀桿菌S01及其相關(guān)的模式菌株脂肪酸組成比較（％ )
[0036]

[0037]注："Summedfeature7"表示該組份是未知的C1S.S46或C19:1〇6c 表示未檢測 到該組分；
[0038] 綜合表型特征、遺傳發(fā)育分析、化學(xué)分類特征，本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01是棒狀 桿屬的一個(gè)新物種，將其命名為廣東棒狀桿菌（Corynebacteriumguangdongensis)S01，已 于2015年7月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地 址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No:11162〇
[0039] 三、廣東棒狀桿菌SOI產(chǎn)氨基酸成分的測定。
[0040] 挑取本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01的單菌落，接種至200mL的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基中，180rpm搖床30°C振蕩培養(yǎng)2天。取5mL發(fā)酵菌液采用滅菌的一次性過濾器（孔徑 0. 02ym)的過濾，收集濾液。采用全自動(dòng)氨基酸分析儀L-8900(日立）對(duì)濾液中的氨基酸 成分及含量進(jìn)行測定分析。測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣東棒狀桿菌S01能夠產(chǎn)生15種氨基酸（表3)。
[0041] 表3廣東棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)氨基酸成分及含量
[0042]

[0043]經(jīng)氨基酸分析儀分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的廣東棒狀桿菌SOI在液體培養(yǎng)過程中能 產(chǎn)生的15種不同的氨基酸，如表3所示。產(chǎn)量較大的為精氨酸（534. 2mg/L)、苯丙氨酸 (233.43mg/L)、賴氨酸（218.14mg/L)、亮氨酸（166.67mg/L)。此外，還能產(chǎn)生酪氨酸、丙氨 酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸、胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸。因此， 本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01在開發(fā)氨基酸類產(chǎn)品中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 廣東棒狀桿菌（Corynebacterium guangdongensis)S01，保藏編號(hào)為 CGMCC No: 11162〇2. 廣東棒狀桿菌（Corynebacterium guangdongensis)S01在制備天冬氨酸、蘇氨酸、 谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴 氨酸、組氨酸和/或精氨酸中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種廣東棒狀桿菌及其應(yīng)用。廣東棒狀桿菌(Corynebacterium？guangdongensis)S01于2015年7月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC？No:11162。本發(fā)明的廣東棒狀桿菌(Corynebacterium？guangdongensis)S01能產(chǎn)天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸等15種氨基酸。因此，本發(fā)明的廣東棒狀桿菌S01在開發(fā)氨基酸類產(chǎn)品中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。CGMCC No: 1116220150731
【IPC分類】C12P13/22, C12P13/20, C12P13/10, C12P13/08, C12R1/15, C12N1/20, C12P13/24, C12P13/06, C12P13/14, C12P13/04, C12P13/12
【公開號(hào)】CN105112323
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510497963
【發(fā)明人】羊宋貞, 朱紅惠, 馮廣達(dá), 李燕旋, 楊瑞恒
【申請(qǐng)人】廣東省微生物研究所
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2015年8月14日