從魷魚(yú)軟骨中提取非變性ii型膠原蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及II型膠原蛋白的提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種從魷魚(yú)軟骨中提取非變性II型膠原蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]II型膠原蛋白(collagen type II,C II)是構(gòu)成軟骨的主要成分之一，其具有的三條a i鏈以三股螺旋的形式結(jié)合，通過(guò)共價(jià)鍵交聯(lián)，形成特殊的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)保持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性有著重要作用。II型膠原蛋白是一種與多糖緊密結(jié)合的蛋白，能促進(jìn)鈣、磷等無(wú)機(jī)礦物質(zhì)在骨骼上的沉積，修復(fù)組織，與蛋白多糖在組織中相互作用，使軟骨及韌帶組織富有彈性。
[0003]II型膠原是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的一種自身抗原、抗膠原抗體和膠原特異T細(xì)胞，在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。RA是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)慢性炎癥疾病，我國(guó)RA的患病率為0.24-0.5%，女性多于男性。RA的發(fā)生很可能是由于機(jī)體內(nèi)的T細(xì)胞因子引起關(guān)節(jié)組織內(nèi)部對(duì)特異性隱蔽抗原進(jìn)行的自身免疫反應(yīng)，造成軟骨組織破壞，產(chǎn)生關(guān)節(jié)滑膜炎癥。有研究認(rèn)為，主要的免疫原就是II型膠原，II型膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵是T細(xì)胞對(duì)II型膠原分子中特定肽段的識(shí)別作用。已有報(bào)道非變性II型膠原蛋白可以產(chǎn)生免疫耐受使類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病受到抑制，并且通過(guò)口服方法改善癥狀。
[0004]關(guān)節(jié)軟骨的功能主要是支持和分散力量，保持關(guān)節(jié)表面潤(rùn)滑，利于關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)。因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能性，關(guān)節(jié)軟骨易受到磨損而產(chǎn)生關(guān)節(jié)缺損病癥。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增值能力極低，缺損軟骨自身無(wú)法修復(fù)，組織工程技術(shù)已漸成為新的軟骨缺損修復(fù)手段。非變性II型膠原具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的作用，并可為軟骨細(xì)胞的黏附提供基礎(chǔ)。以高純度的非變性II型膠原蛋白與透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、殼聚糖等交聯(lián)制備的軟骨組織工程支架材料，具有低抗原性和良好的生物相容性，在軟骨缺損修復(fù)中極具開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
[0005]魷魚(yú)是一種海洋軟體動(dòng)物，身體分為頭部、很短的頸部和軀干部。魷魚(yú)軟骨位于魷魚(yú)頸部，約占魷魚(yú)體重的2%左右，魷魚(yú)軟骨中含有豐富的II型膠原蛋白。我國(guó)魷魚(yú)捕獲量巨大，每年可達(dá)50-60萬(wàn)噸，大量的魷魚(yú)軟骨多以副產(chǎn)物處理，其高值化應(yīng)用未得到重視。魷魚(yú)軟骨中含有63.8% (干基)粗蛋白、14.2% (干基)灰分和14.6% (干基)多糖。由于軟骨中含有的多糖即硫酸軟骨素是一種可以有效改善關(guān)節(jié)疼痛的保健食品，因此在提取多糖時(shí)而未能很好利用II型膠原蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提出一種從魷魚(yú)軟骨中提取非變性II型膠原蛋白的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種從魷魚(yú)軟骨中提取非變性II型膠原蛋白的方法，包括:
[0009]冷凍干燥魷魚(yú)軟骨；
[0010]粉碎冷凍干燥后的所述魷魚(yú)軟骨，過(guò)篩網(wǎng)，得軟骨粉；[0011 ] 所述軟骨粉先后用HCl溶液、EDTA溶液和NaOH溶液混懸，得到沉淀物；
[0012]所述沉淀物加入乙酸溶液和蛋白酶中，攪拌，離心，取上清液；在該上清液中加飽和NaCl溶液至NaCl濃度為I?1.5M，靜置16?24h，離心，去上清液，得到第一沉淀物；
[0013]用酸溶解所述第一沉淀物，然后進(jìn)行透析，之后冷凍干燥，即得非變性II型膠原蛋白O
[0014]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述篩網(wǎng)的目數(shù)為多100目。篩網(wǎng)目數(shù)小時(shí)軟骨粉顆粒較粗，軟骨粉與混懸液接觸不夠充分，會(huì)造成軟骨前處理中脫灰、除多糖不完全，在膠原提取時(shí)II型膠原難以溶出。
[0015]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述混懸的具體過(guò)程為:
[0016]HCl溶液混懸，4?6°C緩慢攪拌12?24h，離心，去上清液，得到第二沉淀，用4?6°C去離子水清洗所述第二沉淀；
[0017]所述第二沉淀再用EDTA溶液混懸，4?6°C緩慢攪拌12?24h，離心，去上清液，得到第三沉淀，用4?6°C去離子水清洗所述第三沉淀；
[0018]所述第三沉淀用NaOH溶液混懸，4?6°C緩慢攪拌24?48h，離心，去上清液，得到第四沉淀，用4?6°C去離子水清洗所述第四沉淀。
[0019]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述HCl溶液的pH為2.0?3.0 ;EDTA溶液的pH為8.0，濃度為0.5?IM ;所述NaOH溶液濃度為0.1M?0.5M。
[0020]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述軟骨粉與HCl溶液料液比(w/v)為1:30?50 ;軟骨粉與m)TA溶液料液比(w/v)為1:30?50 ;軟骨粉與NaOH溶液料液比(w/v)為1:30?50。
[0021]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述軟骨粉與乙酸溶液料液比(w/v)為1:50?80。
[0022]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述乙酸溶液的濃度為0.5?1M。
[0023]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述蛋白酶為胃蛋白酶。
[0024]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述胃蛋白酶與沉淀物的比(w/w)為0.2?0.5%o高于該料液比時(shí)，提取時(shí)間會(huì)比較長(zhǎng)，同時(shí)蛋白分子量會(huì)變小。
[0025]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述沉淀物加入乙酸溶液和蛋白酶中，攪拌，離心，可以進(jìn)行1-3次，合并上清液，進(jìn)行下一步反應(yīng)。
[0026]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，溶解所述第一沉淀物的酸為乙酸，其濃度為0.2-0.5M。
[0027]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述非變性II型膠原蛋白的分子量300?330kDa，具有完整的三維螺旋結(jié)構(gòu)。
[0028]有益效果
[0029](I)本發(fā)明選用魷魚(yú)軟骨作為原料，其中的冷凍干燥可以防止膠原蛋白變性，方便后續(xù)工藝的操作，提高提取效率。同時(shí)軟骨前處理、膠原提取和純化等過(guò)程均在低溫條件下進(jìn)行，避免了因溫度過(guò)高而造成II型膠原蛋白的變性。
[0030](2)魷魚(yú)軟骨中灰分和多糖含量較高，且與膠原結(jié)合在一起；本發(fā)明在魷魚(yú)軟骨前處理過(guò)程中，采用HCl溶液和EDTA溶液對(duì)軟骨粉進(jìn)行脫灰處理，脫灰效果完全，利于后續(xù)操作，提高了提取純度；用NaOH溶液去除軟骨中的硫酸軟骨素；這些前處理操作，有利于II型膠原分離。
[0031](3)本發(fā)明的提取得到的II型膠原蛋白的純度彡95%。
【附圖說(shuō)明】
[0032]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施方案或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施方案或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方案，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0033]圖1為實(shí)施例1制備的非變性II型膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0035]實(shí)施例1
[0036]—種從魷魚(yú)軟骨中提取非變性II型膠原蛋白的方法，包括:
[0037](I)取新鮮魷魚(yú)剝離出軟骨，去除其上附著的筋肉，_40°C真空冷凍干燥；
[0038](2)將凍干的魷魚(yú)軟骨粉碎成100目粒徑軟骨粉；
[0039](3)稱取10g魷魚(yú)軟骨粉，用3000mL pH2.0HCl溶液混懸，4°C緩慢攪拌24h，4°C、10000r/min離心30分鐘，去上清液；
[0040](4)沉淀用4°C去離子水充分清洗，40C、10000r/min離心，保留沉淀；
[0041](5)沉淀用 3000mL 0.5M EDTA 溶液(pH 8.0)混懸，4°C 緩慢攪拌 24h，4°C、1000r/min離心3