一種極細(xì)鏈格孢菌及其在鐵皮石斛促生、抗旱中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種極細(xì)鏈格孢菌及其在鐵皮石斛促生、 抗旱中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等功效，是 我國(guó)藥典中記載的極為珍稀名貴中藥材，是一些中成藥、保健品的必需原料素。菌根是土壤 中菌根真菌與植物根系形成的具有特定形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的共生體，是自然界中普遍存在的 一種共生現(xiàn)象。蘭科植物對(duì)菌根的依賴性較強(qiáng)，菌根真菌與植物根系互為條件形成共生體， 在生理上是一個(gè)相互協(xié)調(diào)的整體，并在共同進(jìn)化的過(guò)程中，形成特定的形態(tài)特征。由于蘭科 植物和真菌具有天然的共生關(guān)系，從其種子萌發(fā)到苗的健康生長(zhǎng)，無(wú)不需要真菌的參與，這 使得鐵皮石斛的人工栽培較為困難，并且人工種植生長(zhǎng)速度慢，平均產(chǎn)量低，病害發(fā)生較為 嚴(yán)重。目前，需求主要靠采挖野生資源，致使野生鐵皮石斛資源瀕臨枯竭，已被國(guó)家列為二 類重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物。菌根真菌與宿主植物的相互關(guān)系多數(shù)情況下是互利的，菌根真菌 從植物體內(nèi)獲取生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而植物通過(guò)與共生真菌結(jié)合，也能更好的從土壤中 得到所需的養(yǎng)分及水分等。近年來(lái)，有不少學(xué)者在石斛屬植物的菌根結(jié)構(gòu)、菌根真菌的多樣 性、菌根真菌對(duì)石斛屬植物的作用研究等方面開(kāi)展了大量研究，為充分利用菌根的優(yōu)良特 性進(jìn)行鐵皮石斛的高效人工栽培奠定了基礎(chǔ)。
[0003] 菌根真菌對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的作用。如對(duì)鐵皮石斛的組織培養(yǎng)苗進(jìn)行人工 接種瘤菌根菌（Epulorhiza)菌株60d后，接菌苗平均鮮重增長(zhǎng)率比對(duì)照苗高出了 84.8% ; 鐵皮石斛組培苗接種蘭科絲核菌類Cymbidiumfaberikanran和Cymbidiumsinense后， 平均鮮重增長(zhǎng)率均達(dá)到了極顯著差異的水平，接種Cymbidiumgoeringii和Cymbidium goeringii的組培苗達(dá)到了顯著差異的水平；小燕屬的內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)鐵皮石斛幼苗的 生長(zhǎng)發(fā)育；從獨(dú)蒜蘭（Pleionebulbocodioides)分離出的GN09、GN10和GN43菌株與環(huán) 草石斛（DendrobiumloddigesiiRolfe)組培苗共生培養(yǎng)后，組培苗的鮮重增長(zhǎng)率分別比 對(duì)照提高了 69. 8%、61. 9%和81. 7%，顯著地具有重大的應(yīng)用價(jià)值。從保護(hù)生態(tài)環(huán)境和食 品安全的角度出發(fā)，鐵皮石斛作為名貴中藥，盡可能化學(xué)肥料的施用量，可以大大提高產(chǎn)品 品質(zhì)，達(dá)到安全食用的目的，這也符合農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)鐵皮石斛促生、抗逆作用效果顯著的地 菌根真菌--半知菌亞門(mén)鏈格孢屬極細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuissima)。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述真菌在提高鐵皮石斛生長(zhǎng)速度、抗旱能力 中的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種極細(xì)鏈格孢菌，其分類命名為半知菌亞門(mén)鏈格孢屬極細(xì)鏈格孢菌 (Alternariatenuissima)，菌株號(hào)為JSNL005-1，現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11311，保藏日期為2015年9月11日。 保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0008] 上述菌株JSNL005-1是2013年4月在江蘇省句容市鐵皮石斛栽植區(qū)內(nèi)生長(zhǎng)狀況 較好的植株上分離獲得的，該菌株對(duì)鐵皮石斛具有顯著的促生作用，也能明顯改善鐵皮石 斛的抗旱能力。
[0009] 極細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuissima)JSNL005-1的菌落特征如下：在PDA平板 上培養(yǎng)，菌絲發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)快，氣生菌絲質(zhì)疏，初期灰白色至灰色，顏色逐漸變深至灰青色，菌 落邊緣整齊。擴(kuò)增ITS區(qū)全序列并進(jìn)行測(cè)序，PCR擴(kuò)增得到的16sRNA全序列如SEQIDNo: 1所示。
[0010] 上述極細(xì)鏈格孢菌在促進(jìn)鐵皮石斛生長(zhǎng)中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 上述極細(xì)鏈格孢菌在提高鐵皮石斛的抗旱能力中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
[0012] 具體的應(yīng)用方法是：將極細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuissima)JSNL005-1制備 成固體菌劑，置于鐵皮石斛幼苗栽培基質(zhì)表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑接種量為5g， 施用菌劑后，基質(zhì)相對(duì)含水量維持在60%以上10天，以確保菌絲在基質(zhì)內(nèi)成活。
[0013] 其中，所述的固體菌劑按如下方法制備得到：以棉籽殼菌渣為培養(yǎng)基質(zhì)、硫酸酸銨 為外源氮源、葡萄糖為外源碳源，制備成固體培養(yǎng)基，滅菌，無(wú)菌條件下接種極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)JSNL005-1，在 26°C、12h光照 +12h黑暗、pH6_8 條件下培養(yǎng) 15 ~ 20天，將培養(yǎng)好的菌劑切割成lcm3大小的塊狀物，用于鐵皮石斛植株菌根菌劑的接種。 [0014] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0015] (1)極細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuissima)JSNL005-1對(duì)鐵皮石斛的促生和抗 逆的作用效果均較為顯著，對(duì)減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的使用有一定作用，也是保證食用安全 的重要手段。
[0016] (2)極細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuissima)JSNL005-1培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、容易保 存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為JSNL005-1菌落培養(yǎng)照片。
[0018] 圖2為JSNL005-1對(duì)鐵皮石斛植株的促生效果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1 :
[0021] 將菌根真菌極細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuissima)JSNL005-1制備成固體菌劑。 具體制備方式為：以棉籽殼菌渣為培養(yǎng)基質(zhì)、硫酸酸銨為外源氮源、葡萄糖為外源碳源，制 備成固體培養(yǎng)基質(zhì)裝入高壓滅菌袋內(nèi)，于121°C和101. 3千帕的高壓條件下滅菌20分鐘。 待培養(yǎng)基質(zhì)冷卻后在無(wú)菌條件下接種菌根真菌JSNL005-1，然后進(jìn)行人工培養(yǎng)。具體培養(yǎng)條 件為26°C、12h光照+12h黑暗、pH6. 0,培養(yǎng)20天。將培養(yǎng)好的菌劑加工成lcm3大小的塊 狀物，放置于當(dāng)年栽種的鐵皮石斛幼苗栽培基質(zhì)表面。栽培鐵皮石斛選用口徑15cm的營(yíng)養(yǎng) 缽，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽栽培1叢（5株）鐵皮石斛。接種時(shí)選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的鐵皮石斛植株，并進(jìn) 行苗高和地徑的測(cè)定。每叢鐵皮石斛種苗的固體菌劑接種量為5g。施用菌劑后，基質(zhì)相對(duì) 含水量維持在60%以上10天，確保菌絲在基質(zhì)內(nèi)成活。接種后6個(gè)月，進(jìn)行鐵皮石斛根系 的菌根化程度檢測(cè)，確保接種的菌根真菌極細(xì)鏈格孢菌（Umbelopsisdimorpha)JSNL005-1 已與鐵皮石斛根部結(jié)合，形成了菌根。接種后12個(gè)月，進(jìn)行鐵皮石斛菌根化植株的促生和 抗旱效果分析（表1、表2)。以未接種菌根菌劑，僅接種等量棉籽殼菌渣的鐵皮石斛植株為 對(duì)照植株（CK)。
[0022] 鐵皮石斛植株的干旱脅迫處理：選取不同處理的菌根化鐵皮石斛，統(tǒng)一進(jìn)行澆水， 使每盆植株的土壤含水量達(dá)到飽和，然后在溫室內(nèi)模擬自然干旱脅迫，使水分不斷消耗，在 脅迫第10d、20d、30d進(jìn)行萎蔫度、萎蔫率的測(cè)定。溫室內(nèi)溫度為30-35°C，空氣相對(duì)濕度為 50-60%。每種處理50株，做3個(gè)重復(fù)。
[0023] 在干旱脅迫條件下，按照以下標(biāo)準(zhǔn)將各處理鐵皮石斛的受旱程度分為5級(jí)：0 :健 康；I:少數(shù)葉片出現(xiàn)萎蔫；II:半數(shù)葉片出現(xiàn)萎蔫；III:半數(shù)以上葉片萎蔫；IV:整株萎蔫。 統(tǒng)計(jì)各處理植株的萎蔫率和萎蔫度。
[0024] 萎蔫率（％ )=(出現(xiàn)萎蔫癥狀株數(shù)/處理株數(shù)）X100%
[0025] 萎蔫度=[E(萎蔫級(jí)數(shù)X株數(shù)）X100V(萎蔫最高級(jí)數(shù)X總株數(shù)）
[0026] 表1JSNL005-1對(duì)鐵皮石斛植株的促生效果
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[0028] 表2JSNL005-1對(duì)鐵皮石斛植株抗旱能力的作用效果 [00291
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種極細(xì)鏈格孢菌，其分類命名為半知菌亞門(mén)鏈格孢屬極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima)，菌株號(hào)為JSNL005-1，現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 11311，保藏日期為2015年9月11日。2. 權(quán)利要求1所述的極細(xì)鏈格孢菌在促進(jìn)鐵皮石斛生長(zhǎng)中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima) JSNL005-1制備成固體菌劑，置于鐵皮石斛幼苗栽培基質(zhì)表面，每叢鐵皮石斛 幼苗的固體菌劑接種量為5g，施用菌劑后，基質(zhì)相對(duì)含水量維持在60 %以上10天，以確保 菌絲在基質(zhì)內(nèi)成活。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固體菌劑按如下方法制備得到：以 棉籽殼菌渣為培養(yǎng)基質(zhì)、硫酸酸銨為外源氮源、葡萄糖為外源碳源，制備成固體培養(yǎng)基，滅 菌，無(wú)菌條件下接種極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima) JSNL005-1，在26°C、12h光照 +12h黑暗、pH6-8條件下培養(yǎng)15~20天，將培養(yǎng)好的菌劑切割成Icm 3大小的塊狀物，用于 鐵皮石斛植株菌根菌劑的接種。5. 權(quán)利要求1所述的極細(xì)鏈格孢菌在提高鐵皮石斛抗旱能力中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，將極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima) JSNL005-1制備成固體菌劑，置于鐵皮石斛幼苗栽培基質(zhì)表面，每叢鐵皮石斛 幼苗的固體菌劑接種量為5g，施用菌劑后，基質(zhì)相對(duì)含水量維持在60 %以上10天，以確保 菌絲在基質(zhì)內(nèi)成活。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固體菌劑按如下方法制備得到：以 棉籽殼菌渣為培養(yǎng)基質(zhì)、硫酸酸銨為外源氮源、葡萄糖為外源碳源，制備成固體培養(yǎng)基，滅 菌，無(wú)菌條件下接種極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima) JSNL005-1，在26°C、12h光照 +12h黑暗、pH6-8條件下培養(yǎng)15~20天，將培養(yǎng)好的菌劑切割成Icm 3大小的塊狀物，用于 鐵皮石斛植株菌根菌劑的接種。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種極細(xì)鏈格孢菌，其分類命名為半知菌亞門(mén)鏈格孢屬極細(xì)鏈格孢菌(Alternaria？tenuissima)，菌株號(hào)為JSNL005-1，現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC？No.11311，保藏日期為2015年9月11日。本發(fā)明極細(xì)鏈格孢菌JSNL005-1在提高鐵皮石斛生長(zhǎng)速度、抗旱能力等方面作用效果顯著；且能夠人工培養(yǎng)，繁殖速度快，便于進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。CGMCC No.1131120150911
【IPC分類】C12R1/645, C12N1/14, A01G1/00, A01G7/06, A01P21/00, A01N63/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105132293
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510624306
【發(fā)明人】徐超, 賈君, 張紅巖, 汪善峰, 鄭凱, 趙桂華, 楊鶴同, 席剛俊, 史俊
【申請(qǐng)人】江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年9月25日