抗hdl單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤的制作方法
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及HDL單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤。
[0002]【背景知識(shí)】
[0003]高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein ;HDL)是血液中密度最高、顆粒最小的血漿脂蛋白，其直徑為7.5?10nm，密度為1.21g/cm3，含有6%膽固醇、13%膽固醇酯與50%蛋白質(zhì)，分子量為(1.5?3) X 106，其載脂蛋白大多為載脂蛋白A。在肝、腸和血液中合成，擔(dān)負(fù)著將內(nèi)源性膽固醇(以膽固醇酯為主)從組織往肝臟的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。血漿高密度脂蛋白含量的高低與患心血管病的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。由于可輸出膽固醇促進(jìn)膽固醇的代謝，所以現(xiàn)在作為動(dòng)脈硬化預(yù)防因子而受到重視。高密度脂蛋白運(yùn)載周圍組織中的膽固醇，再轉(zhuǎn)化為膽汁酸或直接通過(guò)膽汁從腸道排出，動(dòng)脈造影證明高密度脂蛋白膽固醇含量與動(dòng)脈管腔狹窄程度呈顯著的負(fù)相關(guān)。所以高密度脂蛋白是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護(hù)因子。俗稱“血管清道夫”。
[0004]高密度脂蛋白是血脂代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，專門在體內(nèi)結(jié)合多余血脂，轉(zhuǎn)運(yùn)體外，清除血液垃圾；且由于體積小，能穿透動(dòng)脈內(nèi)膜將沉積在里面的膽固醇清除掉并攜帶出去血管壁，修復(fù)血管內(nèi)皮破損細(xì)胞，恢復(fù)血管彈性，具有清除血管餒多余血脂，清除血垢，清潔血管的作用。正常的血脂代謝是指高密度脂蛋白的數(shù)量與低密度脂蛋白或甘油三酯是成比例的，即一個(gè)高密度脂蛋白分子可以“運(yùn)輸”5-6個(gè)低密度脂蛋白或甘油三酯分子到肝臟進(jìn)行分解處理，最終排出體外。當(dāng)?shù)兔芏戎鞍谆蚋视腿ヅc高密度脂蛋白的數(shù)量比例失調(diào)時(shí)，就會(huì)使血液中的總膽固醇或甘油三酯等指標(biāo)超出正常范圍，打破了原正常的血脂代謝平衡，發(fā)生異常，被稱為“垃圾”的多余血脂就會(huì)俯著在血管壁上沉積，逐漸形成粥樣硬化，最終導(dǎo)致心腦血管病的發(fā)生。因此說(shuō)高密度脂蛋白的數(shù)量不僅決定著血液中血脂代謝是否平衡，而且還起到消退或減輕動(dòng)脈硬化斑快的重要作用。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種抗HDL單克隆抗體以及建立一種簡(jiǎn)單且具高靈敏度的檢測(cè)HDL含量的方法，該方法可應(yīng)用于癌癥的檢測(cè)。以解決現(xiàn)有的單克隆抗體檢測(cè)HDL的靈敏度不夠或價(jià)格昂貴，不適合臨床大規(guī)模的應(yīng)用的缺點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明獲得了能夠產(chǎn)生特異性識(shí)別HDL的單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細(xì)胞株1-35-1與雜交瘤細(xì)胞株1-10-1，此2株細(xì)胞株分別在2015年7月17日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201598與CCTCC NO:C201599。此外，經(jīng)過(guò)鑒定，兩株單克隆抗體分別識(shí)別HDL的兩個(gè)不同表位，通過(guò)1-35-1與1-10-1的結(jié)合建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法，其是一種高靈敏度及高通量的檢測(cè)系統(tǒng)。
[0007]因此，本發(fā)明提供了下面所述的I至3的內(nèi)容:
[0008]1.抗HDL的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)分別為CCTCC NO:C201598和CCTCC NO:C201599。
[0009]2.抗HDL的單克隆抗體，分別由保藏號(hào)為CCTCC NO:C201598和CCTCC NO:C201599的雜交瘤細(xì)胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為1-35-1和1_10_1。
[0010]3.如權(quán)利要求2所述的抗HDL單克隆抗體的應(yīng)用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)HDL，夾心法兩兩配對(duì)的抗體來(lái)源于保藏號(hào)為CCTCC NO:C201598雜交瘤分泌的抗體1-35-1和保藏號(hào)為CCTCC NO:C201599雜交瘤分泌的抗體1_10_1，其步驟包括:
[0011](I)以所述的兩兩配對(duì)的單克隆抗體1-35-1包被；
[0012](2)加入待測(cè)樣品孵育；
[0013](3)以所述的兩兩配對(duì)的HRP標(biāo)記的另一株單克隆抗體1-10-1作為二抗，加入反應(yīng)體系；
[0014](4)洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD值；
[0015](5)結(jié)果表明檢測(cè)的靈敏度很高。
【【附圖說(shuō)明】】
[0016]附圖1顯示的是本發(fā)明中的雜交瘤所產(chǎn)生的抗HDL單克隆抗體在ELISA方法中滴度測(cè)量結(jié)果。
[0017]附圖2顯示的是標(biāo)記HRP的抗HDL單克隆抗體滴度測(cè)量結(jié)果。
[0018]附圖3顯示的是夾心法ELISA(S-ELISA)系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度。
【【具體實(shí)施方式】】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解，在闡述了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)和修改，這些等價(jià)形式同樣是本申請(qǐng)中權(quán)利要求書中所限定的范圍。
[0020]實(shí)施例1:動(dòng)物免疫
[0021 ] 選擇與所用的骨髓瘤細(xì)胞同源的8周齡左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量為30ug的HDL與弗氏完全佐劑、PBS混合，完全乳化后，30ug每只每次，采取背部多點(diǎn)，及腋下、腹股溝免疫。免疫程序:經(jīng)15天后進(jìn)行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進(jìn)行第三次相同劑量與福氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測(cè)血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強(qiáng)免疫；3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0022]實(shí)施例2:雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建
[0023]1、骨髓瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)及制備
[0024](I)本發(fā)明采用的是SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳，倍增時(shí)間為10-12小時(shí)。融合時(shí)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞在融合前應(yīng)先在培養(yǎng)基上作適應(yīng)培養(yǎng)，使細(xì)胞生長(zhǎng)到最佳的狀態(tài)(即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)；
[0025](2)將培養(yǎng)的SP2/0吸至50mL的管中，離心，棄上清，懸起，加1mL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋計(jì)數(shù)。
[0026]2、脾細(xì)胞的制備
[0027](I)將小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；
[0028](2)將小鼠消毒固定在解剖板上，在超凈工作臺(tái)中取脾，放在12mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剝掉粘連組織，研磨脾臟，直至剩白色組織為止，吸管全部吸起，再緩慢打出使組織塊粘連的管壁上，離心，棄上清，加1mL的紅細(xì)胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培養(yǎng)基終止其反應(yīng)，離心后，棄上清，加1mL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋計(jì)數(shù)。
[0029]3、細(xì)胞融合
[0030]加強(qiáng)免疫后3天做細(xì)胞融合。
[0031]細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞1: 10混和，通過(guò)聚乙二醇(PEG)法以獲得雜交瘤細(xì)胞，命名為1-35-1和1-10-1。所獲得的雜交瘤細(xì)胞懸浮在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)12天。
[0032]實(shí)施例3:單克隆抗體的制備及篩選
[0033]1、單克隆抗體的制備
[0034]從實(shí)施例2中所獲得的雜交瘤細(xì)胞的孔格中回收培養(yǎng)基的上清液，選取在ELISA方法中與HDL抗原反應(yīng)的單克隆抗體。
[0035]2、單克隆抗體的篩選
[0036](I)將10uL濃度為0.5ug/mL的HDL抗原到96孔板的每個(gè)孔格中，于4°C過(guò)夜后使其固定于固相；
[0037](2)用150uL濃度為I %的牛血清白蛋白進(jìn)行封閉2小時(shí)；
[0038](3)將10uL雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液加入到每個(gè)孔格中，于37°C反應(yīng)2小時(shí)，然后加入稀釋10000倍的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體于37°C反應(yīng)I小時(shí)；
[0039](4)使用四甲基聯(lián)苯胺微孔過(guò)氧化物酶底物(TMB)作為底物進(jìn)行顯色20min ;
[0040](5)添加50uL濃度為0.lmol/L的硫酸終止反應(yīng)后，測(cè)量450nm的吸光度；
[0041](6)選出吸光度大約為3的1-35-1和1_10_1，并通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。
[0042]3、單克隆抗體的大量制備及和純化
[0043]將亞克隆后的細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，約20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)進(jìn)行親和層析純化。得到的單克隆抗體分別命名為1_35_1與
l-10-lo
[0044]4、單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
[0045]所篩選出的2種mAb的效價(jià)通過(guò)ELISA方法來(lái)測(cè)定。分別加入1-35-1、1-10-1 (10ug/mL)，在反應(yīng)后，使用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體與TMB進(jìn)行顯色，兩種mAb效價(jià)達(dá)到10 9以上(附圖1所示)。
[0046]實(shí)施例4:單克隆抗體的標(biāo)記及滴度的測(cè)定
[0047]將純化出得各抗體按常規(guī)方法進(jìn)行HRP標(biāo)記，標(biāo)記好的單克隆抗體的滴度通過(guò)下面的方法測(cè)定，將濃度為0.5ug/mL的HDL抗原固定在96孔微板上(10uL/孔)。使用I %的牛血清白蛋白進(jìn)行封閉2小時(shí)，加標(biāo)記的單克隆抗體(第一孔稀釋100倍)，從第二孔開(kāi)始做4倍稀釋，于室溫下反應(yīng)2小時(shí)。添加TMB后，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20分鐘，用0.1mol/L的硫酸中止反應(yīng)。測(cè)量在450nm的吸光度，按實(shí)施例3中的方式獲得針對(duì)固定在固相中的抗原的滴度。結(jié)果表明具有有效的滴度(附圖2所示)。
[0048]實(shí)施例5:雙抗體夾心ELISA檢測(cè)HDL方法的建立
[0049](I)以所述的兩兩配對(duì)的單克隆抗體之一包被，0.5ug/mL的單克隆抗體以10uL/孔的量加到微孔板土，于4°C孵育24小時(shí)固定于固相；
[0050](2)孔格使用含有 0.1 % Tween 20 的 pH 值為 7.4 的 20mM PBS (PBST)，以 200uL/孔的量洗滌2次。以150uL/孔的量加入I %牛血清白蛋白進(jìn)行封閉2小時(shí)；
[0051](3)孔格用PBST以200uL/孔的量洗滌4次，加入由起始濃度10ug/mL連續(xù)4倍稀釋HDL抗原，于室溫溫育2小時(shí)，然后加入HRP標(biāo)記的另一株抗體(I: 5000 ；10uL/孔)并于室溫溫育2小時(shí)；
[0052](4)添加TMB后，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20分鐘，加入0.lmol/L的硫酸來(lái)終止反應(yīng)并測(cè)量450nm的吸光度；
[0053](5)結(jié)果表明檢測(cè)的靈敏度很高(附圖3所示)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.抗HDL的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)分別為CCTCCNO:C201598和CCTCC NO:C201599。2.抗HDL的單克隆抗體，分別由保藏號(hào)為CCTCCNO:C201598和CCTCC NO:C201599的雜交瘤細(xì)胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為1-35-1和1-10-1。3.如權(quán)利要求2所述的抗HDL單克隆抗體的應(yīng)用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)HDL，夾心法兩兩配對(duì)的抗體來(lái)源于保藏號(hào)為CCTCC NO:C201598雜交瘤分泌的抗體1-35-1和保藏號(hào)為CCTCC NO:C201599雜交瘤分泌的抗體1_10_1，其步驟包括: (1)以所述的兩兩配對(duì)的單克隆抗體1-35-1包被； (2)加入待測(cè)樣品孵育； (3)以所述的兩兩配對(duì)的HRP標(biāo)記的另一株單克隆抗體1-10-1作為二抗，加入反應(yīng)體系; (4)洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD值； (5)結(jié)果表明檢測(cè)的靈敏度很高。
【專利摘要】抗HDL單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤的制備，屬于免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種特異性識(shí)別HDL的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，以及使用該單克隆抗體檢測(cè)HDL的高靈敏度的方法。CCTCC NO：C20159820150717
【IPC分類】G01N33/577, C12N5/20, G01N33/92, G01N33/574, C07K16/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105132381
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510454240
【發(fā)明人】李春雷, 劉云成, 李喜梅, 侯杰, 竇巍巍, 董小芳
【申請(qǐng)人】大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月25日