源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗人食管癌藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗人食管癌藥物的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物堿是一類由生物次級代謝產(chǎn)生的含氮有機化合物，自然界中的生物堿種類較 多，大多來源于植物，因此又有植物堿之稱。生物堿對人和動物有重要的生理作用，包括平 喘鎮(zhèn)咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等，其中以抗菌、抗腫瘤活性最為突出。天然結(jié) 構(gòu)生物堿是創(chuàng)新藥物研究中發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的重要來源，目前應(yīng)用于臨床的生物堿藥物已 經(jīng)近百種。研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋真菌能夠在次級代謝過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性好的生物 堿，具有很好的藥用和產(chǎn)業(yè)化前景。
[0003] 本發(fā)明人研究得知，桔青霉（/feniciUiwa?ciIBPT-5，（已于2013年12 月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：CCTCCNO:M 2013713)的發(fā)酵產(chǎn)物的粗提取物有很好的細(xì)胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進(jìn)行研究。 研究發(fā)現(xiàn)所示生物堿類化合物具有抗人食管癌活性，目前尚未見該化合物對人食管癌細(xì)胞 EC-9706、KYSE450的增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗人食管癌 藥物的應(yīng)用。該化合物具有抑制人食管癌細(xì)胞增殖作用，具有抗人食管癌活性。其結(jié)構(gòu)式 為.
[0005] 該化合物的制備方法，是通過發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉興）IBPT-5， 獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物。具體步驟如下： 1發(fā)酵生產(chǎn) 培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔青霉IBPT-5接種到PDA固體 斜面培養(yǎng)基上在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后接種到培養(yǎng)液中，28°C靜止培養(yǎng)30天后，獲得 菌絲體和發(fā)酵液；所述培養(yǎng)液組成：每升水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0g、麥芽糖20.0g、 味精 10.0g、葡萄糖 10.0g、KH2P04 0 . 5g、MgS04 0 . 3g、NaCl30.0g; 2浸膏的獲得 用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液用乙酸乙酯1:2 (v/v)萃取兩次，萃取液減 壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏32.0g。
[0006] 3化合物的分離精制 該浸膏通過100-200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色 譜柱梯度洗脫，得到11個組分。組分7 (4.2g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:l的洗脫物）以 二氯甲烷：甲醇為洗脫液，進(jìn)一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的亞組分7-6 (二氯 甲烷：甲醇v/v=50:l的洗脫物）通過半制備液相色譜（1010型0DS-A，10X250mm，5ym): 分離流速為5mL/min，流動相為75%乙腈含0. 1%TFA，得到所示化合物（97. 9mg，tR 19. 3 min) 〇
[0007] 所述桔青霉（Penicilliumcitrinum)IBPT-5,已于2013年12月25日保藏在中 國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：CCTCCNO:M2013713。
[0008] 所述的化合物在制備抑制人食管癌細(xì)胞增殖藥物中的用途，及該化合物在制備抗 人食管癌藥物中的用途。所述腫瘤細(xì)胞為人食管癌細(xì)胞EC-9706、KYSE450。
[0009] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點：研究所示該生物堿化合物較為罕見，所述生物堿類化合物 具有顯著的抑制人食管癌細(xì)胞增殖活性，目前尚未見該化合物對人食管癌細(xì)胞EC-9706、 KYSE450增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。
【附圖說明】
[0010] 圖 1PenicitrinineA主要的COSY，HMBC和N0ESY信號。
【具體實施方式】
[0011] 在如下的實施例中所指的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0012] 實施例1該化合物的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制 1發(fā)酵生產(chǎn) 生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔青霉（ci IBPT-5 (已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢武漢大學(xué)， 保藏編號是：CCTCCNO:M2013713)接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 天。
[0013] 取斜面培養(yǎng)4天的桔青霉（/feniciUiwa?citri/wa?)IBPT-5接種到裝有400mL培 養(yǎng)液[培養(yǎng)液組成（克/升）：甘露醇20. 0,酵母膏3. 0,麥芽糖20. 0,味精10. 0,葡萄糖 10. 0,KH2P04 0? 5,MgS04 0? 3,NaCl30. 0 定容]的 1000mL錐形瓶中，28°C靜止培養(yǎng) 30 天 后，獲得菌絲體和發(fā)酵液。
[0014] 2浸膏的獲得 用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液用乙酸乙酯1:2 (v/v)萃取兩次，萃取液減 壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏32.0g。
[0015] 3化合物的分離精制 該浸膏通過200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色譜柱 梯度洗脫，得到11個組分。組分7 (4.2g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:l的洗脫物）以二 氯甲烷：甲醇為洗脫液，進(jìn)一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的亞組分7-6 (二氯甲 烷：甲醇v/v=50:1的洗脫物）通過半制備液相色譜（1010型0DS-A，10X250mm，5ym): 分離流速為5mL/min，流動相為75%乙腈含0. 1%TFA，得到所示化合物（97. 9mg，tR 19. 3 min) 〇
[0016] 化合物黃色油狀，高分辨質(zhì)譜HRESI-MS在餘々484. 2711處給出分子離子峰[M -H]_，（calcd.forC2SH3SN06，484. 2705)，提示分子量為485,結(jié)合波譜信息推測分子式 為C2SH39N06。4和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1，主要的COSY，HMBC和N0ESY信號見圖1。
[0017] 表 1NMR化合物的1H和13C-NMR數(shù)據(jù)（500MHz4and125MHz13C，inCDC13)
實施例2體外抗腫瘤活性的測試 1實驗樣品及實驗方法 被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施1中分離精制的化合物純品。精密稱取適 量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供測活性。
[0018] 細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)采用腫瘤細(xì)胞系，腫瘤細(xì)胞用含10%FBS的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37 °C于通入5% 0)2的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
[0019] 細(xì)胞增殖抑制活性測試方法 WST-1法取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至每毫升5X104個細(xì)胞，按每孔 100yL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37°C通入5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸去上清 液，加入含樣品的培養(yǎng)基100yL，繼續(xù)培養(yǎng)48h。每孔加入10yLWST-1液，培養(yǎng)4h。 利用Bio-Rad公司產(chǎn)680型酶標(biāo)儀測定每孔在450nm處的吸光值（0D)值。在同一塊96孔 板中樣品的每個濃度均設(shè)置五孔，另設(shè)五孔空白對照和無細(xì)胞調(diào)零孔（如果藥物有顏色要 做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞調(diào)零）。各孔0D值先做相應(yīng)無細(xì)胞調(diào)零，再取五孔平均0D值按IR (%) =(0D空自對照-0D樣品）/0D空自對照X100%式計算每個濃度下細(xì)胞增殖抑制率（IR%)。
[0020] 2?實驗結(jié)果 細(xì)胞增殖抑制活性測試結(jié)果 在WST-1法測試中，根據(jù)不同濃度的該化合物的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率，應(yīng)用SPSS16. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并計算半數(shù)抑制濃度IC5。值。結(jié)果見表2。
[0021] 表2化合物對人食管癌細(xì)胞增殖的抑制活性
3.結(jié)論 該化合物對人食管癌細(xì)胞EC-9706、KYSE450具有較好的抗腫瘤活性?？勺鳛橹苽淙耸?管癌細(xì)胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于人食管癌的研究。
[0022] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 源于桔青霉的penicitrinine A，其特征在于：所述化合物結(jié)構(gòu)式為2. 如權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于：發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉（ ciiri/w?) IBPT-5,獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物，所述桔青霉 IBPT-5,已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址：武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：CCTCC NO :M 2013713。3. 如權(quán)利要求1所述的化合物在制備抑制人食管癌細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的腫瘤細(xì)胞為人食管癌細(xì)胞 EC-9706、KYSE450。5. 如權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗人食管癌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種源于桔青霉的penicitrinine？A及其制備抗人食管癌藥物的應(yīng)用。該化合物具有抑制人食管癌細(xì)胞增殖作用。其結(jié)構(gòu)式為：。通過發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉？(<i>Penicillium</i><i>？citrinum</i>)？IBPT-5，獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物。經(jīng)實驗證實，該化合物對人食管癌細(xì)胞EC-9706、KYSE450具有較好的抗腫瘤活性?？勺鳛橹苽淙耸彻馨┘?xì)胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于人食管癌的研究。CCTCC NO：M 201371320131225
【IPC分類】C07D491/20, C12R1/80, C12P17/18, A61P1/00, A61P35/00
【公開號】CN105153175
【申請?zhí)枴緾N201510422123
【發(fā)明人】鄭秋紅, 劉沁穎, 陳立, 應(yīng)敏剛, 周彤
【申請人】福建省腫瘤醫(yī)院
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年7月17日