抑制TNFα的穩(wěn)定和可溶的抗體的制作方法
【專利說明】抑制TNFa的穩(wěn)定和可溶的抗體
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00680028415. 3、申請日為2006年6月6日、發(fā)明名稱為"抑 制TNF a的穩(wěn)定和可溶的抗體"的中國專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及優(yōu)化的抗體和抗體衍生物，其與腫瘤壞死因子a (TNF a )結(jié)合并阻斷 其功能，并具有診斷和/或治療、預(yù)防或改善與TNFa相關(guān)的疾病的用途；它們的編碼序列、 生產(chǎn)和在藥理學(xué)上合適的組合物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 腫瘤壞死因子a (TNFa，亦稱惡液質(zhì)素）是天然存在的哺乳動物細(xì)胞因子，由許 多類型細(xì)胞對內(nèi)毒素或其他刺激物應(yīng)答產(chǎn)生，包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。TNFa是炎癥、免 疫和病理生理反應(yīng)的主要介質(zhì)（Grell，M.，等（1995)Cell, 83:793-802)。
[0004] 可溶TNFa由跨膜蛋白前體切割形成（Kriegler，等（1988)Cel 153:45-53)， 分泌的17kDa多肽裝配成可溶同源三聚體復(fù)合物（Smith,等（1987)，J. Biol. Chem. 262:6951-6954 ;對于 TNF 的綜述，參見 Butler,等（1986)，Nature 320:584 ; 01d(1986)，Science 230:630)。然后這些復(fù)合物與各種細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的受體結(jié)合。這種結(jié) 合產(chǎn)生一系列促炎作用，包括（i)釋放其他促炎細(xì)胞因子，如白介素（IL)-6、IL-8和IL-1， (ii)釋放基質(zhì)金屬蛋白酶和（iii)上調(diào)內(nèi)皮粘附分子的表達(dá)，通過吸引白細(xì)胞進入血管外 組織而進一步放大炎癥和免疫級聯(lián)。
[0005] 許多紊亂與TNFa水平升高有關(guān)，其中很多具有顯著的醫(yī)學(xué)重要性。已經(jīng)證明 TNFa在很多人類疾病中被上調(diào)，包括慢性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)，炎性腸紊亂包括 克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，膿毒病，充血性心力衰竭，支氣管哮喘和多發(fā)性硬化。人TNFa 轉(zhuǎn)基因小鼠組成型產(chǎn)生高水平TNFa并發(fā)展為類似RA的自發(fā)、有害的多關(guān)節(jié)炎（Keffer等 1991，EMBOJ.，10, 4025-4031)。因此TNFa被稱為促炎細(xì)胞因子。
[0006] 現(xiàn)在TNF a已被充分確立為RA發(fā)病機理中的關(guān)鍵因素，RA是慢性、進行性和使人 衰弱的疾病，其特征是多關(guān)節(jié)炎癥和破壞，伴發(fā)熱、不適和疲勞的全身癥狀。RA還引起慢性 滑膜炎，經(jīng)常進展為關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞。在遭受RA的患者的滑膜液和外周血液中都發(fā)現(xiàn) TNFa水平增加。當(dāng)將TNFa阻斷劑給予遭受RA的患者時，它們減輕炎癥、改善癥狀和延遲 關(guān)節(jié)損害（McKown 等（l999)，Arthritis Rheum.42:l2〇4_l2〇8) 〇
[0007]在生理學(xué)上，TNF a還與保護不受特殊感染的危害相關(guān)（Cerami.等 (1988)，Immunol. Today 9:28)。TNFa由被革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖激活的巨噬細(xì)胞釋 放。這樣，TNFa可能是與細(xì)菌膿毒病相關(guān)內(nèi)毒素性休克的發(fā)展和發(fā)病機理中涉及的中心 環(huán)節(jié)的內(nèi)源介質(zhì)（Michie,等（1989)，Br.J.Surg. 76:670-671. ;Debets?等（1989)，Second Vienna Shock Forum, p. 463-466 ；Simpson,等（1989)Crit. Care Clin. 5:27-47 ;Waage 等 (1987).Lancet 1:355-357;Hammerle?等（1989)Second Vienna Shock Forum p.715-718 ; Debets?等（1989)，Crit.Care Med. 17:489-497 ;Calandra?等（1990)，J. Infect. Dis.161:982-987;Revhaug 等（1988)，Arch. Surg.123:162-170)〇
[0008] 如同其他器官系統(tǒng)一樣，TNFa也被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，尤其是在 神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和自身免疫紊亂中，包括多發(fā)性硬化、Guillain-Barre綜合征（傳染性神 經(jīng)元炎）和重癥肌無力，和在神經(jīng)系統(tǒng)的退行性紊亂中，包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥 和杭廷頓氏病。TNFa還參與視網(wǎng)膜和肌肉相關(guān)系統(tǒng)的紊亂，包括視神經(jīng)炎、黃斑變性、糖尿 病視網(wǎng)膜病、皮肌炎、肌萎縮性側(cè)索硬化和肌營養(yǎng)不良，以及神經(jīng)系統(tǒng)的損害，包括外傷性 腦損傷、急性脊髓損傷和中風(fēng)。
[0009] 肝炎是另一個與TNFa相關(guān)的炎癥性紊亂，除了其他觸發(fā)物之外，它可以由病毒 感染引起，包括EB病毒、巨細(xì)胞病毒和A-E型肝炎病毒。肝炎引起門脈和小葉區(qū)急性肝炎， 隨后是纖維化和腫瘤發(fā)展。
[0010] TNFa可以在癌癥中介導(dǎo)惡病質(zhì)，后者引起多數(shù)癌癥發(fā)病和死亡（Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305)〇
[0011] TNFa在炎癥、細(xì)胞免疫反應(yīng)和很多疾病的病理過程中所起的關(guān)鍵作用導(dǎo)致人們 探尋TNFa拮抗劑。
[0012] TNFa是重要的細(xì)胞因子，它的全身阻斷帶來臨床上明顯感染的頻率和嚴(yán)重性增 加的風(fēng)險，尤其是潛伏性結(jié)核的重新活化和可能的其他風(fēng)險，包括誘發(fā)淋巴瘤、脫髓鞘疾病 和心力衰竭。
[0013] 設(shè)計用于治療TNFa介導(dǎo)的疾病的一類TNFa拮抗劑是特異性結(jié)合TNFa并由 此阻斷其功能的抗體或抗體片段?？筎NFa抗體的使用表明阻斷TNFa可以逆轉(zhuǎn)歸因 于TNFa的作用，包括IL-1、GM-CSF、IL-6、IL-8、粘附分子和組織破壞減少（Feldmann等 (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350)〇
[0014] 已經(jīng)提議針對TNFa的抗體用于預(yù)防和治療內(nèi)毒素性休克 (Beutler等（1985)Science:234,470-474)。Bodmer等于1993年（Critical Care Medicine, 21:441-446，1993)、Wherry等于1993年（Critical Care Medicine, 21:436-440)和Kirschenbaum等于1998年（Critical Care Medicine, 26:1625-1626)論述了抗TNFa抗體在治療膿毒性休克中的應(yīng)用。
[0015] US2003147891中已經(jīng)公開了一種通過給予抗TNFa單克隆抗體或其TNFa結(jié)合片 段治療人類中神經(jīng)變性疾病的方法。
[0016] W00149321教導(dǎo)了 TNFa阻斷劑，包括抗TNFa抗體治療由TNFa引起的神經(jīng)疾病 和相關(guān)紊亂的用途。它提供了一種通過給予TNFa拮抗劑來治療所述紊亂的方法。
[0017] W003047510公開了針對TNFa的各種類型的單克隆和改造的抗體，它們的生產(chǎn)、 包含它們的化合物和在藥物中的應(yīng)用。
[0018]對治療TNFa介導(dǎo)的疾病有用的抗體通常是單克隆抗體（mAB)或改造的抗體，前 者通過雜交瘤技術(shù)從天然來源，通常是小鼠而產(chǎn)生。后者相應(yīng)于天然存在的抗體，因為它們 包含全長重鏈和輕鏈，或相應(yīng)于也可以由天然抗體蛋白水解分裂產(chǎn)生的Fab片段，或相應(yīng) 于單鏈scFv抗體，其中重鏈和輕鏈可變區(qū)的片段通過肽接頭連接。
[0019] 抗體的重鏈和輕鏈都包含恒定區(qū)和可變區(qū)。由于非人抗體具有免疫原性，因此在 所謂的"雜種"抗體中，抗體中人樣序列的量常常增加，該抗體包含人IgG恒定區(qū)和與動物 抗體序列匹配的可變區(qū)，該動物抗體在多數(shù)情況下是具有期望特異性的鼠抗體。然后這些 可變區(qū)可以通過誘變進一步被改動變得更類似于典型的人抗體，產(chǎn)生"人源化"抗體。在又 一個可供選擇的方法中，僅僅抗原結(jié)合部分，即小鼠抗體可變區(qū)的互補決定區(qū)（CDRs)與人 抗體的構(gòu)架區(qū)結(jié)合，產(chǎn)生"CDR移植"抗體。
[0020] 現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了針對TNF a的單克隆抗體。Meager等1087 (Hybridoma 6:305-311)描述了針對重組TNFa的鼠單克隆抗體。Shimamoto等于1988年（Immunology Letters 17:311-318)描述了針對TNFa的鼠單克隆抗體在預(yù)防小鼠內(nèi)毒素性休克中的應(yīng) 用。
[0021] US5919452公開了抗TNFa嵌合抗體以及它們在治療與TNFa存在相關(guān)的病理改 變中的應(yīng)用。
[0022] Feldman等于（I"8)年（Transplantation Proceedings3。：4126_4：127)、Adorini 等于1997年（Trends in Immunology Todayl8:209-211)和Feldmann等于1997年 (Advanced Immunology64:283-350)論述了抗TNFa抗體在治療RA和克羅恩病中的應(yīng)用。 這種療法中使用的TNF a的抗體一般是嵌合抗體，如US5919452中描述的抗體。
[0023] US20003187231公開了具有結(jié)合提高的特征的含至少一個非人⑶R區(qū)的人源化抗 TNFa抗體。此外，在國際專利申請W0 92/11383中公開了對TNFa特異性的重組抗體，包 括 CDR 移植抗體。Rankin 等于（1995)，（British J. Rheumatology 34:334-342)描述了這 種CDR移植抗體在RA治療中的應(yīng)用。
[0024] W09211383公開了一種對TNF a特異性的重組的人源化⑶R移植抗體，其來源于鼠 單克隆抗體61E7、hTNFI、hTNF3或101. 4,并且它教導(dǎo)了所述抗體的生產(chǎn)和在診斷和/或治 療與TNFa相關(guān)的紊亂中的應(yīng)用。
[0025] 在僅僅最近才成為市場上可買到的TNFa的特異性抑制劑當(dāng)中，已經(jīng)證 明針對TNF a的單克隆、嵌合小鼠-人抗體（英夫利昔單抗，Remicade?;Centocor Corporation/Johnson&Johnson)在治療 RA 中的臨床功效（Elliott et. al. 1994, Lancet 344:1105-1110 ;Mani 等（1998)，Arthritis&. Rheumatism 41:1552-1563).也已經(jīng)證明英 夫利昔單抗在治療炎性腸紊亂克羅恩病中的臨床功效（Baert等，1999, Gastroenterology 116:22-28.)〇
[0026] US22002037934公開了通過給予抗TNF a抗體如英夫利昔單抗治療肝炎。
[0027] US6428787教導(dǎo)了用抗TNFa抗體治療神經(jīng)疾病和與TNFa相關(guān)的疾病，包括英夫 利昔單抗、CDP571和D2E7。
[0028] 業(yè)已開發(fā)了 一種人抗TNFa單克隆抗體（Abbott)D2E7(Adalimumab)治療RA 和克羅恩病（W09729131)。Celltech正在開發(fā)一種人源化單克隆抗TNFaIgG4抗體 CDP571 (EP0626389)來治療克羅恩病，和一種人源化單克隆抗TNF a抗體片段CDP870來治 療RA。US2003185826中公開了局部給予治療局部紊亂的所述抗體。
[0029]產(chǎn)生了針對眾多不同抗原的很多單鏈抗體（scFvs)，特別是因為使用技術(shù)，例如噬 菌體展示或核糖體顯示可以容易地選擇高結(jié)合能力的抗體。而且，可以在微生物系統(tǒng)中生 產(chǎn)scFv抗體，這與生產(chǎn)治療性全長抗體相比費用較低有關(guān)。
[0030] 除常規(guī)細(xì)胞外和體外應(yīng)用之外，scFvs也已經(jīng)成功用于細(xì)胞內(nèi)（Worn等 2000, JBC, 28 ;275(4):2795-2803 ;Auf der Maur 等 2002, JBC, 22 ;277(47):45075-45085 ; Stocks MR, 2004, Drug Discov Today. 15 ;9(22):960-966);因此，已經(jīng)開發(fā)了針對細(xì)胞 內(nèi)抗原的scFvs。通常，功能性scFvs的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)受到它們的不穩(wěn)定性、不溶性和形成 聚集體傾向的限制。因為這個原因，使用所謂的"質(zhì)量控制"篩選已經(jīng)成功開發(fā)了體內(nèi)篩 選scFv抗體的系統(tǒng)，其在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境（例如核、細(xì)胞質(zhì)）典型的還原條件下特別可溶和 穩(wěn)定（TO0148017;Auf der Maur 等（2001)，F(xiàn)EBS Lett. 508:407-412 ;Auf der Maur 等 (2004)，Methods 34:215-224)，并且已經(jīng)致使鑒定到了為了這種目的的特別穩(wěn)定和可溶的 scFv構(gòu)架序列（W003097697)。此外，這些構(gòu)架在天然氧化條件下細(xì)胞外環(huán)境中亦顯示出異 常的表達(dá)水平以及穩(wěn)定性和可溶性性能增加。因此，這些有利的生物物理和生化特性轉(zhuǎn)化 為有利的高產(chǎn)量和使這些抗體片段一旦對準(zhǔn)特異性抗原就能夠作為蛋白治療劑在特定治 療區(qū)域進行局部和/或全身應(yīng)用。由于scFv抗體和Fab片段與全長抗體相比缺少被單核 細(xì)胞例如天然殺傷細(xì)胞的Fc受體識別的Fc部分，因此它們不引起依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo) 細(xì)胞毒性（ADCC)并因此不會引起由于與非靶細(xì)胞上Fc受體結(jié)合造成的無特異性的毒性。
[0031] 因此，需要用于治療與TNF a相關(guān)的紊亂如RA的新的有效形式的抗體，尤其是通 過局部給藥可以提供持續(xù)、可控制療法且副作用程度低的治療。本發(fā)明提供了有效和連續(xù) 治療關(guān)節(jié)炎及其他TNFa介導(dǎo)的紊亂的炎性過程或病理生理機制，尤其是各種形式疼痛的 抗體、組合物和方法。
[0032] 本文引用的全部出版物和參考文獻以它們的整體在此引入作為參考。
[0033] 發(fā)明公開內(nèi)容
[0034]因此，本發(fā)明的一般目的是提供在體外和體內(nèi)特異性結(jié)合TNF a的穩(wěn)定和可溶的 抗體或抗體衍生物。在優(yōu)選實施方案中，所述抗體衍生物是scFv抗體或Fab片段。
[0035] 現(xiàn)在，為了實施本發(fā)明的這些目的和隨著描述的進行會變得更顯然的其它目的， 所述抗體或抗體衍生物表現(xiàn)出以下特征：它包含是或衍生自序列SEQ ID NO: 1的輕鏈可變 域，其與是或衍生自序列SEQ ID N0:2的重鏈可變域組合，其中在衍生序列的情況下，所述 序列在所述VL域的構(gòu)架區(qū)內(nèi)具有最多達(dá)到5個改變和/或在所述VH域的構(gòu)架內(nèi)具有最多 達(dá)到9個改變。
[0036] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是所述抗體或抗體衍生物，其中在構(gòu)架區(qū)中任何位置 導(dǎo)入一個或多個氨基酸改變，優(yōu)選在選自下組的一個或多個位置：VL域的4、46、65、67、70 和83位，和/或在選自下組的一個或多個位置：VH域的11、16、28、43、48、68、70、71、72、73、 76、77、79、93和112位。更優(yōu)選，至少一個轉(zhuǎn)變產(chǎn)生在3￡0 10勵:3(對于￥〇和/或3￡0 IDN0:4 (對于VH)中存在的氨基酸，和甚至更優(yōu)選總共存在最多13個轉(zhuǎn)變。
[0037] 最優(yōu)選，所述抗體或抗體衍生物包含序列SEQ ID N0:1的VL域和/或序列SEQ ID NO: 2的VH域或衍生自該序列SEQ ID NO :2的VH域，或序列SEQ ID NO: 11的VL域和序 列SEQ ID NO: 4的VH域。如果本發(fā)明抗體的VH域包含SEQ ID NO: 1的VL域，在優(yōu)選實施 方案中，VH序列衍生自SEQ ID N0:2使得在68位苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼帷⒘涟彼?、異亮?酸或纈氨酸。VH內(nèi)外加的改變是任選的。這個類型的scFv抗體在SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36 和 SEQ ID NO:37 中給出。
[0038] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體或抗體衍生物衍生自具有VL序列 SEQ ID N0:1和VH序列SEQ ID N0:2的抗體，并且包含至少一個在至少一個CDRs中轉(zhuǎn)變 為VL序列SEQ ID N0:5和/或VH序列SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:25的相應(yīng)CDR中存在 的殘基的氨基酸殘基。
[0039] 在本發(fā)明的非常優(yōu)選的實施方案中，在所述抗體或抗體衍生物中，VL CDR2、VL CDR3、VH CDR2或VH CDR3中至少一個CDR轉(zhuǎn)變?yōu)閂L序列SEQIDNO: 5和/或VH序列SEQ IDNo:25 或 SEQIDN0:6 的相應(yīng)CDR。
[0040] 最優(yōu)選，所述抗體或抗體衍生物包含下列VL/VH序列組合：
[0041] VL SEQ ID N0:7/VH SEQ ID N0:2、
[0042] VL SEQ ID N0:8/VH SEQIDN0:2、
[0043] VL SEQ ID N0:1/VH SEQIDN0:9、
[0044] VL SEQ ID N0:1/VH SEQ ID N0:25、
[0045] VL SEQ ID N0:1/VH SEQIDN0:28、
[0046] VL SEQ ID N0:1/VH SEQIDN0:29、
[0047] VL SEQ ID N0:26/VH SEQ ID N0:30、
[0048] VL SEQ ID N0:27/VH SEQ ID N0:30〇
[0049] 在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體衍生物對人TNFa具有特異性。 優(yōu)選，抗原結(jié)合的特征是1^為~100nM或更低。更優(yōu)選，抗體的K為10nM或更低，最優(yōu)選 InM或更低。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的抗體衍生物是例如Fc融合體、毒素融合體、與酶活性的融合體、不 同形式如微抗體（minibodies)、雙功能抗體（diabodies)、線性抗體、單鏈抗體、雙特異性 抗體片段，特別是scFv和Fab片段。
[0051] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選目的是scFv抗體，其VL和VH域通過接頭連接，優(yōu)選以VL-接 頭-VH序列方式排列。更優(yōu)選所述接頭具有序列SEQ ID N0:10。
[0052] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選目的是衍生自SEQIDNO: 40 (TB-A)的scFv抗體。這種抗體 可以通過誘變獲得，和在構(gòu)架區(qū)、CDR和/或接頭序列中包含三個或更少突變。優(yōu)選，scFv 抗體具有序列 SEQIDN0:20、SEQIDN0:21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、 SEQIDN0:31、SEQIDN0:32、SEQIDN0:33、SEQIDN0:34、SEQIDN0:35、SEQIDN0:36、 SEQIDNO:37 或 SEQIDNO:38.
[0053] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選目的是Fab片段，其包含與人Igk鏈恒定區(qū)融合的VL域，和 與人IgG的CH1域融合的VH域，兩個融合多肽通過鏈間二硫鍵連接。
[0054] 在又一個方面，本發(fā)明的抗體或抗體衍生物，例如抗體片段被標(biāo)記或化學(xué)修飾。
[0055] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明任何抗體或抗體衍生物的DNA序列，以及含所述DNA 序列的克隆或表達(dá)載體。此外，提供了用所述DNA序列轉(zhuǎn)化的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，優(yōu)選是大腸 桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞。
[0056] 此外，提供了生產(chǎn)本發(fā)明抗體或抗體衍生物的方法，包括在允許抗體或抗體衍生 物合成的條件下培養(yǎng)用編碼任何所述抗體或抗體衍生物的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和從所述 培養(yǎng)物中回收所述分子。優(yōu)選，所述方法提供了從大腸桿菌純化的scFv抗體或Fab片段。
[0057]