一種通過提高胞內(nèi)輔酶水平加強(qiáng)2,3-丁二醇合成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種通過提高胞內(nèi)輔因子水平加強(qiáng)2, 3-下二醇合成的方法，屬于基因工程技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著能源資源的日益短缺和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，開發(fā)可再生的生物質(zhì)資源為原 料，經(jīng)過化學(xué)、生物及其集成方法生產(chǎn)各種化學(xué)品、功能材料和能源物質(zhì)的生物煉制技術(shù)越 來越受到國內(nèi)外的高度重視。2, 3-下二醇是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于化工、 食品、燃料及航空航天等領(lǐng)域。2, 3-下二醇脫氨生成雙乙酷，是一種高價(jià)值食品風(fēng)味劑，具 有一定的抑菌效果；在脫氨酶的作用下，生成的3-徑基-2-下酬（乙偶姻）是一種應(yīng)用廣 泛的天然食用香料；脫水生成的甲乙酬可作為一種高價(jià)值的液體燃料添加劑，亦是重要的 低沸點(diǎn)溶劑，應(yīng)用于涂料、粘結(jié)劑、潤滑劑、燃料、油墨等行業(yè)；脫水生成的1，3-下二締可用 于合成橡膠、ABS樹脂及SBS彈性體等；醋化產(chǎn)品是合成聚醋和聚氨醋的前體。而且2, 3-下 二醇是一種極具價(jià)值的液體燃料，其燃燒值與甲醇（22.化J/g)、乙醇（29.OkJ/g)相當(dāng)。由 于2, 3-下二醇的高辛燒值，它可作為汽油的辛燒值提升劑或航空燃料另外，2, 3-下二醇及 其衍生物亦可廣泛用于藥用載體、增塑劑、柔軟劑等的生產(chǎn)。
[0003] 近年來用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-下二醇取得了較好的實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果，但生物 法生產(chǎn)2, 3-下二醇尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。目前報(bào)道的2, 3-下二醇生產(chǎn)菌株多為克雷伯氏菌 屬化Iebsiella)腸桿菌屬巧nterobacter)和沙雷氏菌屬（Serratia)等，運(yùn)些菌種具有 潛在致病性，不符合符合工業(yè)化安全生產(chǎn)的要求。因此，使用安全菌種利用葡萄糖發(fā)酵生 產(chǎn)2, 3-下二醇具有良好的工業(yè)化前景。本發(fā)明人在前期研究中篩選得到一株安全菌株 Bacillusamyloliquefaciens，該菌具有良好的2, 3-下二醇生產(chǎn)潛力，但是發(fā)酵過程中積 累較多的副產(chǎn)物是乙偶姻（又名3-徑基-2-下酬），而2, 3-下二醇的合成最后一步是乙偶 姻還原酶催化還原乙偶姻合成2, 3-下二醇，此反應(yīng)需要還原型輔酶NADH的參與。因此胞 內(nèi)輔酶NAMl水平的高低是影響乙偶姻向2, 3-下二醇轉(zhuǎn)化程度的一個(gè)重要因素。為進(jìn)一步 提高該菌株2, 3-下二醇合成能力，并減少副產(chǎn)物乙偶姻的積累，發(fā)明人提出了一種通過提 高輔酶水平提高Bacillusamyloliquefaciens合成2, 3-下二醇能力的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種通過提高輔酶水平提高Bacillus amyloliquefaciens 合成2, 3-下二醇能力的方法。 陽0〇5] 本發(fā)明所使用菌種為BacillusamyloliquefaciensB10-127 (已保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號為：CCTCCNO:M2012349,已在已授權(quán)專利中公開，授權(quán)號：ZL201310342414. 8)。本發(fā)明首先WBacillusamyloliquefaciens染色體為模板克隆獲 得NADH氧化酶（nox)，隨后根據(jù)NCBIOittp: //Ww.ncbi.nlm.nih.gov/)甲酸脫氨酶（f化） 基因（登錄號：KM454879. 1)人工合成拙!基因，并將拙!基因和質(zhì)粒pM5-地all(該 質(zhì)粒相關(guān)信息已在申請人前期申請的專利中公開，【申請?zhí)枴?01310342415. 2)連接構(gòu) 建pM5-地all-f化質(zhì)粒，并將化all-f化基因片段插入到基因nox內(nèi)部，獲得片段 nox::化all-f化，并將該片段導(dǎo)入解淀粉芽抱桿菌B10-127中，通過同源重組原理獲得染 色體組上基因nox內(nèi)部被f化基因插入的重組解淀粉芽抱桿菌（重新命名為NA巧。并對 原始菌及重組菌NAF進(jìn)行2, 3-下二醇發(fā)酵性能檢測，說明該策略能夠提高2, 3-下二醇 產(chǎn)量，降低副產(chǎn)物乙偶姻的積累。NADH氧化酶來源于解淀粉芽抱桿菌。基于W上研究，對原 始菌W及重組菌pAG進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與原始菌株相比，重組菌2, 3-下二醇產(chǎn)量提 高了 18. 9%，副產(chǎn)物乙偶姻產(chǎn)量降低70. 8%。該輔因子改造策略不限于在解淀粉芽抱桿菌 進(jìn)行輔因子改造，同樣適用于其他的2, 3-下二醇生產(chǎn)菌株。此外，該輔因子改造策略不限 于用于提高2, 3-下二醇的產(chǎn)量，同樣適用于其他的需要輔酶NADH參與的化合物的輔酶代 謝改造。同樣，在此改造基礎(chǔ)上，可W通過阻斷其他副產(chǎn)物代謝途徑進(jìn)一步提高2, 3-下二 醇的產(chǎn)量。同時(shí)該改造策略等同于下述策略：首先敲除或插入失活NADH氧化酶，隨后過量 表達(dá)甲酸脫氨酶。
[0006] 本發(fā)明的有益效果：
[0007] 本發(fā)明人所用菌株是一株安全菌株B.amyloliquefaciens，通過提高輔酶水平提 高B.amyloliquefaciens合成2, 3-下二醇效率，并減少發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙偶姻的積累， 運(yùn)有利于提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施例1:目的基因的擴(kuò)增及重組解淀粉芽抱桿菌的構(gòu)建
[0009]片段nox: :f化獲得具體過程如下：
[0010]首先，W菌株B10-127的染色體DNA為模板，利用引物Pl和P2,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增 得到基因nox巧酸序列如SEQIDNO:1所示的，將純化后的nox基因連接至質(zhì)粒PMD-18T 上，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-nox，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后，表明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。隨后，利用引物P3 和P4通過PCR擴(kuò)增得到核巧酸序列為SEQIDNO:2所示的基因f化，將純化后的f化基 因經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和MluI消化后，與同樣經(jīng)過上述兩種限制性內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒 pMA5-地all連接，獲得pMA5-地all-f化，利用引物P5和P6通過PCR擴(kuò)增得到Hpall-f化； 并將其插入到重組質(zhì)粒T-nox內(nèi)部，構(gòu)建另一個(gè)重組載體T-nox::化all-f化。將重組質(zhì)粒 T-nox::化all-f化經(jīng)BamHI和MluI兩種限制性內(nèi)切酶消化后獲得片段nox::化all-f化， 將片段nox::化all-f化W電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至解淀粉芽抱桿菌，在含有甲酸的平板上 挑取陽性轉(zhuǎn)化子，即得到染色體組上基因nox內(nèi)部被化all-f化基因片段插入的重組解淀 粉芽抱桿菌NAF。 W11]PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)如下：
[0012] Pl: 5ACCG(說ATCCATGACGAATACIX'TGGAT-3' BamHi P2: 5'-ACCGACCKCTTTACAGCCAAGTTGATAC斗 MluI P3; 5'-CGCCATATGATGAAGATCGTTTTAGTC-3' NdcI P4; 5CGCACGCGTTTATTTCTTATCGTGTTTA.C-3' MluI P5; 5'-ACCGAGC、GCTATTTT['TGAGTGATCTTCTC-3， Eco47 111
[0013] P括 5'-在CC掃AGC〇eTTmTTTCrTATCGTGTTTAC-3 ' Eeo47III
[0014] 實(shí)施例2:菌原始菌及重組菌的發(fā)酵性能驗(yàn)證
[0015] (1)種子培養(yǎng)
[0016] 從活化平板上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速 16化/min,培養(yǎng)時(shí)間為1化左右，種子培養(yǎng)基組成：酵母提取物5gA，膜蛋白腺lOg/L^Cl lOg/Lo
[0017] 似發(fā)酵培養(yǎng)
[0018] 初始發(fā)酵培養(yǎng)體積為2.化，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下：
[0019] 發(fā)酵培養(yǎng)基成分：葡萄糖160g/l，玉米漿5g/l，尿素3g/l，巧樣酸鋼6g/L， K2HP〇44g/L，M拆〇4〇. 2g/L;將上述發(fā)酵培養(yǎng)基用5mol/L的化OH調(diào)節(jié)其抑至6. 5,在121°C 下高溫滅菌30min。
[0020] 發(fā)酵發(fā)酵條件：將上述培養(yǎng)好的種子液按4%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā) 酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度37°C，空氣流量為120m3A?m3培養(yǎng)基，攬拌轉(zhuǎn)速為35化/min。定時(shí)取樣 測定細(xì)胞濃度、底物殘留量和3-徑基-2-下酬產(chǎn)量。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中產(chǎn)物2, 3-下二 醇和乙偶姻用氣相色譜測定（GC-1690J氣相色譜儀，杭州科曉化工儀器公司）。色譜條件如 下：毛細(xì)管柱，30mX0. 32mm色譜柱中固定液為AT.SE-30，，檢測器為FID，柱溫150°C，汽化 室與檢測器的溫度均為250°C，載氣為成，流速0.IMpa,進(jìn)樣量2yL采用外標(biāo)法定量。利用 液相色譜分析發(fā)酵液中有機(jī)酸含量。色譜條件：色譜柱為KC-811，流動(dòng)相A為4mM高氯酸， 流動(dòng)相6為超純水，流動(dòng)相梯度為0~7.511111125%~75%4,7.51~1511111175%4，流動(dòng)相 流速為1. 0血/min,紫外檢測波長為210nm，進(jìn)樣量為20y1，柱溫為60°C。結(jié)果表明，與原 始菌株相比，重組菌2, 3-下二醇產(chǎn)量提高了 18. 9%，副產(chǎn)物乙偶姻酸的積累降低70. 8%。
[0021] (3)補(bǔ)料流加發(fā)酵培養(yǎng)
[0022] 種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)條件和實(shí)施例3(1)和3(2)相同，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖殘留濃 度低于20g/l，通過補(bǔ)料累一次性補(bǔ)加60-70g/L左右的葡萄糖，當(dāng)葡萄糖消耗速率低于6g/ L?h時(shí)停止補(bǔ)料，當(dāng)殘留在發(fā)酵液中的葡萄糖被消耗完時(shí)結(jié)束發(fā)酵。通過補(bǔ)料流加發(fā)酵， 2, 3-下二醇產(chǎn)量達(dá)到130.Ig/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基因片段，其特征在于，將Hpall-fdh基因插入到SEQ ID NO 1所示序列的NADH 氧化酶基因內(nèi)容，獲得基因片段nox: :HpaII-fdh。2. -種重組解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的基因片段導(dǎo)入到解淀 粉芽孢桿菌中，通過同源重組獲得重組解淀粉芽孢桿菌。3. -種2, 3- 丁二醇生產(chǎn)效率加強(qiáng)的菌株，其特征在于，權(quán)利要求2獲得的重組解淀粉 芽孢桿菌用于2, 3- 丁二醇生產(chǎn)。4. 一種適合于其它2, 3- 丁二醇產(chǎn)生菌株的改造策略，其特征在于，如權(quán)利要求1、2和 3所構(gòu)成的菌株改造策略。5. -種適合于其它需要NADH參與的產(chǎn)物合成的菌株改造策略，其特征在于，如權(quán)利要 求1、2和3所構(gòu)成的菌株改造策略。
【專利摘要】2,3-丁二醇的合成最后一步是乙偶姻還原酶催化還原乙偶姻合成2,3-丁二醇，此反應(yīng)需要還原型輔酶NADH的參與，因此，胞內(nèi)輔酶NADH水平的高低是影響乙偶姻向2,3-丁二醇轉(zhuǎn)化程度的一個(gè)重要因素。為進(jìn)一步提高該菌株2,3-丁二醇合成能力，并減少副產(chǎn)物乙偶姻的積累，發(fā)明人將HpaII-fdh片段插入到基因nox內(nèi)部，獲得片段nox::HpaII-fdh，并將該片段導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌B10-127中，通過同源重組原理獲得染色體組上基因nox內(nèi)部被fdh基因插入的重組解淀粉芽孢桿菌(重新命名為N△F)。并對原始菌及重組菌N△F進(jìn)行2,3-丁二醇發(fā)酵性能檢測，結(jié)果表明，與原始菌株相比，重組菌2,3-丁二醇產(chǎn)量提高了18.9％，副產(chǎn)物乙偶姻產(chǎn)量降低70.8％。說明該策略能夠提高2,3-丁二醇產(chǎn)量，降低副產(chǎn)物乙偶姻的積累。
【IPC分類】C12P7/18, C12R1/07, C12N1/21, C12N15/53
【公開號】CN105154456
【申請?zhí)枴緾N201510524310
【發(fā)明人】饒志明, 楊套偉, 胡桂元, 劉梅, 戴悅, 劉暢, 李磊, 周昌洋, 張顯, 徐美娟
【申請人】江南大學(xué), 江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所, 如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年8月24日