缺失型地中海貧血等位基因的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于巧光水解探針?lè)ǖ目焖贆z 測(cè)-a21^9缺失型地中海貧血等位基因的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 地中海貧血也稱珠蛋白合成障礙性貧血，簡(jiǎn)稱地貧。地中海貧血是廣西地區(qū)最常 見(jiàn)的單基因遺傳疾病之一，常見(jiàn)的地貧種類有a-地貧和0-地貧。中國(guó)人群中，a-地貧 的基因型常見(jiàn)的為缺失型一SE\-a37和-a42。2013年，欽州市婦幼保健院檢測(cè)出了一種 命名為'欽州型a地貧缺失型'的罕見(jiàn)地貧基因型，由于該基因型的分子生物學(xué)機(jī)制為a 珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中一段21. 9化的DNA序列的缺失，因此簡(jiǎn)寫為-a3L9^ong J, Yan S, Lao K, Pang W, Ye X, Sun L. The diagnosis and molecular analysis of a novel 21. 9kbdelet ion(Qinzhou type deletion)causing曰+thalassemia. Blood Cells Mol Dis.2014 ;52 (4) :225-9.)。在日常工作中，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)該基因型在廣西有一定的分布幾率， 為降低該基因型的漏診，需建立一種可W快速-aU'9等位基因的檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于巧光水解探針?lè)ǖ目焖贆z測(cè)-a21^9缺 失型地中海貧血等位基因的試劑盒。采用該試劑盒可W實(shí)現(xiàn)單管單次反應(yīng)完成-a2I'9缺 失型地中海貧血等位基因的檢測(cè)，且具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，W及較高的特異 性。
[0004] 本發(fā)明所述的基于巧光水解探針?lè)ǖ目焖贆z測(cè)-a21^9缺失型地中海貧血等位基 因的試劑盒，包括擴(kuò)增引物和巧光探針，其特征在于：
[0005] 所述的擴(kuò)增引物為：一對(duì)可W擴(kuò)增a-珠蛋白基因簇中-aU'9等位基因的特征序 列的引物21.9-F和21.9-R，其中：
[0006] 21. 9-F:5'-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3,；
[0007] 21. 9-R:5'-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3';
[0008] 所述的巧光探針為特異性檢測(cè)21. 9-F和21. 9-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針21. 9-Prob， 具體為：
[0009] 21. 9-Prob:5'-6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-B冊(cè)-1-3,。
[0010] 上述試劑盒中的巧光探針中，F(xiàn)AM指簇基巧光素，B冊(cè)-1是指巧光澤滅基團(tuán)。
[0011] 本發(fā)明所述的基于巧光水解探針?lè)ǖ目焖贆z測(cè)-O21^9缺失型地中海貧血等位基 因的試劑盒，還包括一些現(xiàn)有試劑盒中常規(guī)且必須的組分，如緩沖液、酶液、MgClz和dNTP。 具體地，酶液為Taq聚合酶體系，包括可用于水解探針?lè)ǖ臒釂?dòng)酶體系等；所述緩沖液為 常規(guī)的PCR緩沖液；當(dāng)酶液選擇采用康為世紀(jì)所生產(chǎn)的GoldStarTaqDNAPolymerase時(shí)， 緩沖液則優(yōu)選為與GoldStarTaqDNAPolymerase配套的緩沖液。
[0012] 采用上述試劑盒快速檢測(cè)-aU'9缺失型地中海貧血等位基因的方法包括W下步 驟： 陽(yáng)01引 1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；
[0014]。配制反應(yīng)體系，具體為： 陽(yáng)01引 將引物21. 9-F和21. 9-R，探針21. 9-Prob，W及PCR緩沖液、酶液、MgCl2、dNTP、水 和DNA模板配制成反應(yīng)體系；
[0016] 3)樣本檢測(cè)：分別將配制的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的巧 光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)Cq(Cq值的大小可W反映所檢測(cè)模板數(shù)的多 少）；
[0017] 4)數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判定結(jié) 果，當(dāng)FAM通道有Cq值讀數(shù)時(shí)，則表示該樣本攜帶-a2I'9等位基因；當(dāng)FAM通道沒(méi)有Cq值 讀數(shù)時(shí)，則表示該樣本不攜帶-a21^ 9等位基因。
[0018] 上述方法的步驟1)中，采用現(xiàn)有常規(guī)方法制備DNA模板。
[0019] 上述方法的步驟2)中，反應(yīng)體系中各組分的濃度優(yōu)選為：待檢測(cè)DNA:1~化g/ yL;各引物：0. 3~0. 5ymol/L;探針濃度為0. 3~0. 5ymol/L;DNA模板：20~200ng;儀 離子：1. 5~1. 9mmol/L;反應(yīng)體系的終體積優(yōu)選為20JiL。
[0020] 上述方法的步驟3)中，PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性8~12分鐘，然后95°C15~ 30秒，60°C退火50~70秒，39~49個(gè)循環(huán)，于60°C退火步驟末采集巧光信號(hào)。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的特點(diǎn)在于：
[0022] 1、本發(fā)明所述試劑盒可W實(shí)現(xiàn)單管單次反應(yīng)直接完成-a21^9等位基因的檢測(cè). 對(duì)-a21'9等位基因檢測(cè)具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，W及較高的特異性。
[0023] 2、本發(fā)明所述試劑盒應(yīng)用于巧光水解探針?lè)z測(cè)-a21^9等位基因時(shí)，無(wú)需開管操 作，極大限度地降低了實(shí)驗(yàn)室PCR產(chǎn)物污染的可能。
[0024] 3、采用巧光水解探針的實(shí)驗(yàn)方案比現(xiàn)有其他方法所需時(shí)間少，對(duì)設(shè)備要求不高。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中1#樣本的擴(kuò)增曲線；
[0026] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中2#樣本的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，W更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于W下實(shí)施例。
[002引實(shí)施例1 :采用本發(fā)明所述試劑盒在已知基因型樣本中的檢測(cè)結(jié)果
[0029] 1、試劑盒的組成：
[0030] 可W擴(kuò)增a-珠蛋白基因簇中-Q2I'9等位基因的特征序列的引物對(duì)21.9-F和 21. 9-R：
[0031] 21. 9-F:5,-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3,（SEQIDNO:1);
[0032] 21. 9-R:5'-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3'（沈QIDNO:2);
[0033] 特異性檢測(cè)21. 9-F和21. 9-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針21. 9-Prob為： 陽(yáng)的4] 21. 9-Prob :5, -6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-B冊(cè)-1-3'（SEQ ID NO : 3) O
[0035] 其它組成成分：
[0036] GoldStar Taq DNA Polymerase、與GoldStar Taq DNA Polymerase配套的緩沖液 和dNTPs均購(gòu)自康為世紀(jì)，MgClz購(gòu)自Life Technology。
[0037] 按下述表I配制PCR反應(yīng)體系：
[0038]表1 : (ml表不mmol/L U M表不Ji mol/L)
[0039]
[0040] 2、實(shí)施方法：
[0041] PCR反應(yīng)所用儀器為Bio-Rad實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀CFX96。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 10分鐘，然后95°C 15秒，60°C退火60秒，40個(gè)循環(huán)，于60°C退火步驟末采集巧光信號(hào)。
[0042]樣本處理：采用L油-Aid DNA mini extraction kid度i〇-V, Xiamen)試劑盒抽提 DM, W雙蒸水稀釋至20~20化g/ y L備用。DNA樣本也可采用其他常規(guī)DNA提取方法提 取。
[0043] 樣本檢測(cè)：將1份用常規(guī)方法檢測(cè)確定的已知基因型待檢樣本（簡(jiǎn)稱1#樣本）， W及1份正?；蛐停╝a/aa，N/N)樣本（簡(jiǎn)稱2#樣本），根據(jù)上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程 序，于巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，記錄Cq值。
[0044] 3、樣本來(lái)源：所有樣本均來(lái)源自經(jīng)常規(guī)Gap-PCR技術(shù)確定基因型的DNA樣本。
[0045] 4、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié) 果。若FAM通道有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本攜帶-Q2I'9等位基因；若FAM通道沒(méi)有Cq值讀 數(shù)，則表示該樣本不攜帶-a2I'9等位基因。經(jīng)檢測(cè)分析，1#樣本的FAM通道有Cq值讀數(shù)（擴(kuò) 增曲線如圖1所示，Cq值讀數(shù)由表2所示），表示1#樣本攜帶-aU'9等位基因；2#樣本的 FAM通道沒(méi)有Cq值（譜圖如圖2所示，Cq值讀數(shù)由表3所示），表示2#樣本不攜帶-a21'9 等位基因。
[0046]表2 :
[0047]
[0048] 表 3 :
[0049]
[0050] 可見(jiàn)，采用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行-a2I'9缺失型地中海貧血等位基因檢測(cè)時(shí)，結(jié) 果準(zhǔn)確；而且野生型樣本無(wú)非特異性擴(kuò)增，具有較高的特異性。
[0051] 實(shí)施例2 :本發(fā)明所述試劑盒在隨機(jī)基因型樣本中的檢測(cè)效果。
[0052] 1、試劑盒的組成： 陽(yáng)05引 同實(shí)施例1。
[0054] 2、實(shí)施方法： 陽(yáng)05引 同實(shí)施例1。
[0056] 3、樣本來(lái)源：
[0057] 樣本為12例隨機(jī)樣本（由欽州市婦幼保健院提供），W雙蒸水稀釋至20~20化邑， 作為待檢樣本），W及經(jīng)Gap-PCR驗(yàn)證的2例野生型樣本，2例陽(yáng)性樣本。
[0058] 4、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：
[0059] 根據(jù)實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié)果。若FAM通道有Cq值 讀數(shù)，則表示該樣本攜帶-a21^9等位基因；若FAM通道沒(méi)有Cq值讀數(shù)，則表示該樣本不攜 帶-a21^9等位基因。結(jié)果如下述表4所示。
[0060] 表 4 :
[0061]
[0062] 注：樣本類型中化gCtrl=陰性對(duì)照，PosCtrl=陽(yáng)性對(duì)照，化kn=未知樣本類 型，檢測(cè)結(jié)果中，N/A=無(wú)Cq值。
[0063] 結(jié)果顯示，野生型樣本未檢出Cq值，陽(yáng)性樣本檢出Cq值，隨機(jī)樣本中檢出一
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于熒光水解探針?lè)ǖ目焖贆z測(cè)-a 21'9缺失型地中海貧血等位基因的試劑盒，包括 擴(kuò)增引物和熒光探針，其特征在于： 所述的擴(kuò)增引物為：一對(duì)可以擴(kuò)增a -珠蛋白基因簇中- a 21'9等位基因的特征序列的 引物21. 9-F和21. 9-R，其中： 21. 9-F :5' -GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3' ； 21. 9-R :5' -TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3' ； 所述的熒光探針為特異性檢測(cè)21. 9-F和21. 9-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針21. 9-Prob，具體 為： 21.9-Prob :5' -6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-BHQ-1-3、2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括緩沖液、酶液、 MgCljP dNTP。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于熒光水解探針?lè)ǖ目焖贆z測(cè)-α21.9缺失型地中海貧血等位基因的試劑盒。該試劑盒包括擴(kuò)增引物和熒光探針，擴(kuò)增引物為：一對(duì)可以擴(kuò)增α-珠蛋白基因簇中-α21.9等位基因的特征序列的引物21.9-F和21.9-R，其中：21.9-F：5’-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3’；21.9-R：5’-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3’；熒光探針為特異性檢測(cè)21.9-F和21.9-R擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針21.9-Prob，具體為：21.9-Prob：5’-6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-BHQ-1-3’。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105154578
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510702371
【發(fā)明人】翁勛錦, 葉學(xué)和, 龍駒, 孫雷, 龐婉容
【申請(qǐng)人】欽州市婦幼保健院
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年10月26日