產(chǎn)生能力的試樣，并通過與實(shí)施例2相 同的方法測定病毒感染性滴度。 5) 病毒感染性滴度的測定結(jié)果 由上述結(jié)果可知：無論在HCV吸附期間是否存在HCV顆粒形成促進(jìn)劑，在HCV吸附后添 加HCV顆粒形成促進(jìn)劑進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，均發(fā)現(xiàn)較高的病毒感染性滴度（圖4)。
[0046](實(shí)施例5)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)外的HCV顆粒形成的確認(rèn) 在本實(shí)施例中，通過與實(shí)施例2相同的方法準(zhǔn)備培養(yǎng)細(xì)胞，對于在從HCV吸附期間至感 染后48小時(shí)的期間內(nèi)將HCV顆粒形成促進(jìn)劑添加至化h7-it細(xì)胞中時(shí)對細(xì)胞內(nèi)外的HCV 感染性滴度造成的影響進(jìn)行了確認(rèn)。 在本實(shí)施例中，HCV顆粒形成促進(jìn)劑使用實(shí)施例1的純化洛伐他汀溶液"B15. 4. 1"(圖 1)。W下，在HCV顆粒形成促進(jìn)劑中加入培養(yǎng)液，將病毒接種時(shí)和培養(yǎng)時(shí)的洛伐他汀濃度調(diào) 節(jié)為20yg/ml后進(jìn)行使用。將取代肥V顆粒形成促進(jìn)劑而含有二甲基亞諷值MSO)的組作 為對照組（control)。
[0047] 通過與實(shí)施例2相同的方法調(diào)制用于測定細(xì)胞外的HCV感染性滴度的試樣。通過 凍結(jié)-溶解法調(diào)制用于測定細(xì)胞內(nèi)的HCV感染性滴度的試樣。 首先，在利用PBS將感染細(xì)胞清洗后，通過膜蛋白酶/邸TA處理使其懸浮，通過離屯、而 回收細(xì)胞聚合體（cellpellet)。利用PBS將該細(xì)胞聚合體清洗一次，使其懸浮于0. 5ml的 培養(yǎng)液中，并在-8〇°C下反復(fù)進(jìn)行=次凍結(jié)-溶解，然后W120(K)巧m進(jìn)行五分鐘離屯、，并將 所得到的上清液作為測定用試樣。通過與實(shí)施例2相同的方法測定各試樣的病毒滴度。
[0048] 由上述結(jié)果可知：細(xì)胞內(nèi)的HCV顆粒產(chǎn)生與對照組幾乎無差別，但在細(xì)胞外，利用 HCV顆粒形成促進(jìn)劑處理后的組中的HCV顆粒產(chǎn)生能力明顯高出20倍~30倍（圖5)。 W例（實(shí)施例6)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的HCVRNA拷貝數(shù)的確認(rèn) 在本實(shí)施例中，通過與實(shí)施例2相同的方法準(zhǔn)備培養(yǎng)細(xì)胞，對于在從HCV吸附期間至感 染后48小時(shí)的期間內(nèi)將HCV顆粒形成促進(jìn)劑添加至化h7-it細(xì)胞時(shí)，在HCV感染后第1、2、 3、4天對培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的HCVRNA拷貝數(shù)造成的影響進(jìn)行了確認(rèn)。在本實(shí)施例中，HCV顆粒形 成促進(jìn)劑使用實(shí)施例1的純化洛伐他汀溶液"B15. 4. 1"(圖1)。W下，在HCV顆粒形成促 進(jìn)劑中加入培養(yǎng)液，將病毒接種時(shí)和培養(yǎng)時(shí)的洛伐他汀濃度調(diào)節(jié)為20yg/ml后進(jìn)行使用。 將取代HCV顆粒形成促進(jìn)劑而含有DMSO的組作為對照組。
[0050] 通過與實(shí)施例5相同的方法調(diào)制用于測定細(xì)胞內(nèi)的HCVRNA拷貝的試樣。利用 Trizol(K)Arizol(K)-LSdnvitrogen公司）從感染細(xì)胞中提取總RNA。使用ReverTraAce? qPCR-Kit燈oyobo)在37°C下進(jìn)行15分鐘逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并在98°C下進(jìn)行5分鐘酶失活反應(yīng)， 從而由總RNA合成cDNA。通過使用Li曲t切cler^ASORT-PCR系統(tǒng)的定量RT-PCR法來測 定HCVRNA拷貝數(shù)。HCV特異性引物使用由序列編號(hào)1和2所示的堿基序列構(gòu)成的、針對 NS3 位點(diǎn)的引物，PCR反應(yīng)溶液使用 10y1 2XSYBRWpremixExTaqaakara)、0. 4y1 各引 物（1化mol/y1)、2y1CDNA模板、7. 2y1無菌蒸饋水。PCR條件是在95°C下進(jìn)行10秒鐘 熱變性，然后反復(fù)進(jìn)行40次95°C10秒、60°C20秒的循環(huán)。 (序列號(hào) 1)5' -CTTTGACTCCGTGATCGACT-3' (序列號(hào) 2)5, -CCCTGTCTTCCTCTACCTG-3'
[0051] 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：有無HCV顆粒形成促進(jìn)劑對于細(xì)胞內(nèi)HCVRNA復(fù)制量無影 響（圖6)。另外，通過進(jìn)行免疫染色可知：有無洛伐他汀對于細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白質(zhì)（抗原） 合成量也無影響（圖7)。由運(yùn)些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W推斷：洛伐他汀的HCV產(chǎn)生促進(jìn)作用不是在 HCVRNA復(fù)制或HCV蛋白質(zhì)合成之前的階段，而是在其之后的HCV顆粒形成或釋放的階段中 發(fā)揮作用。
[0052](實(shí)施例7)各種抑制素的HCV顆粒形成促進(jìn)效果 在本實(shí)施例中，對于市售的各種抑制素的HCV顆粒形成促進(jìn)效果進(jìn)行了觀察。
[0053] DHCV顆粒形成促進(jìn)劑 在本實(shí)施例中，HCV顆粒形成促進(jìn)劑使用市售的抑制素制劑。使用了洛伐他?。谰S 諾林（mevinolin) :Sigma-Al化ich公司產(chǎn)生；CAS編號(hào)為75330-75-5)、氣伐他汀鋼（和 光純藥工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)生；CAS編號(hào)為93957-55-2)、辛伐他?。⊿igma-Al化ich公司產(chǎn)生； CAS編號(hào)為79902-63-9)、阿托伐他汀巧=水合物（和光純藥工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)生；CAS編 號(hào)為134523-03-8)W及普伐他汀鋼鹽水合物（和光純藥工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)生；CAS編號(hào)為 81131-70-6)。利用培養(yǎng)液對各抑制素進(jìn)行稀釋，將培養(yǎng)時(shí)的濃度調(diào)節(jié)為表1所示的濃度。 作為對照組，取代肥V顆粒形成促進(jìn)劑而使用DMSO(1yg/ml)。 2) 培養(yǎng)細(xì)胞 在本實(shí)施例中，通過與實(shí)施例2相同的方法對化h7-it細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后使用。 3) HCV顆粒形成促進(jìn)劑的添加時(shí)期 在本實(shí)施例中，在將HCVWmoi= 0. 1的狀態(tài)接種至培養(yǎng)細(xì)胞中，并在37°C下吸附2小 時(shí)后，除去病毒液，并利用培養(yǎng)液清洗=次，然后加入含有HCV顆粒形成促進(jìn)劑的培養(yǎng)液培 養(yǎng)46小時(shí)。 4) 病毒感染性滴度測定方法 通過與實(shí)施例2相同的方法調(diào)制用于確認(rèn)病毒產(chǎn)生能力的試樣，并通過與實(shí)施例2相 同的方法測定病毒感染性滴度。 5) 病毒感染性滴度測定結(jié)果 將上述結(jié)果表示于表1中。由此結(jié)果可知：各抑制素均具有HCV顆粒形成促進(jìn)劑效果。[0054][表1] 各種抑制素（市售品）的HCV顆粒形成促進(jìn)效果 UlN丄UOibAZOiA'VJ 丄Z/丄ZJA
[00對如W上詳細(xì)敘述，通過添加本發(fā)明的肥V顆粒形成促進(jìn)劑而培養(yǎng)肥V感染細(xì)胞，有 望將細(xì)胞培養(yǎng)液的HCV顆粒產(chǎn)生效率提高10倍W上。由此，能夠高效地產(chǎn)生HCV疫苗。進(jìn) 而，通過將HCV感染細(xì)胞與本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑和抗HCV藥物候選物質(zhì)一同進(jìn)行 培養(yǎng)，并測量出細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒滴度和/或HCVRNA拷貝數(shù)，從而能夠?qū)τ诳笻CV藥物 進(jìn)行評價(jià)。另外，還可W使用通過本發(fā)明得到的HCV顆粒高效地產(chǎn)生HCV疫苗。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑，其特征在于，作為活性組分而含有抑制素或其 藥學(xué)上可接受的鹽。2. 如權(quán)利要求1所述的C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑，其特征在于，所述抑制素是選自 由洛伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀以及普伐他汀組成的群中的一種或多種抑制 素。3. 如權(quán)利要求1或2所述的C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑，其特征在于，含有能夠產(chǎn)生 抑制素或其藥學(xué)上可接受的鹽的微生物的培養(yǎng)提取物。4. 如權(quán)利要求3所述的C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑，其特征在于，所述微生物為曲霉 屬絲狀真菌。5. -種C型肝炎病毒顆粒的產(chǎn)生增強(qiáng)方法，其特征在于，在權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所 述的C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑的存在下培養(yǎng)C型肝炎病毒感染細(xì)胞。6. 如權(quán)利要求5所述的C型肝炎病毒顆粒的產(chǎn)生增強(qiáng)方法，其特征在于，在所述C型肝 炎病毒感染細(xì)胞內(nèi)形成C型肝炎病毒蛋白質(zhì)后，添加權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的C型肝 炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑進(jìn)行培養(yǎng)。7. -種C型肝炎病毒疫苗的制造方法，其特征在于，通過使C型肝炎病毒失活而進(jìn)行制 造，其中，所述C型肝炎病毒通過權(quán)利要求5或6所述的C型肝炎病毒顆粒的產(chǎn)生增強(qiáng)方法 產(chǎn)生。8. -種C型肝炎病毒疫苗，其特征在于，通過權(quán)利要求7所述的制造方法進(jìn)行制造。9. 一種抗C型肝炎病毒藥物候選物質(zhì)的評價(jià)方法，其特征在于，在權(quán)利要求1~4中任 一項(xiàng)所述的C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑的存在下，將C型肝炎病毒感染細(xì)胞與抗C型肝 炎病毒藥物候選物質(zhì)一同進(jìn)行培養(yǎng)，從而對于阻礙C型肝炎病毒顆粒的形成的強(qiáng)度進(jìn)行評 價(jià)。10. 如權(quán)利要求9所述的抗C型肝炎病毒藥物候選物質(zhì)的評價(jià)方法，其特征在于，包括 以下工序： 1) 將權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的C型肝炎病毒顆粒形成促進(jìn)劑和抗C型肝炎病毒 藥物候選物質(zhì)添加至C型肝炎病毒感染細(xì)胞中的工序； 2) 對C型肝炎病毒感染細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)工序； 3) 測量出培養(yǎng)后的C型肝炎病毒顆粒的數(shù)量，從而對于阻礙C型肝炎病毒顆粒的形成 的強(qiáng)度進(jìn)行評價(jià)的評價(jià)工序。
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞中的HCV顆粒形成的HCV顆粒形成促進(jìn)劑，進(jìn)而提供一種HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法；另外提供一種抗HCV藥物候選物質(zhì)的評價(jià)方法和HCV疫苗的制造方法；本發(fā)明的HCV顆粒形成促進(jìn)劑以抑制素或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性組分；通過將抑制素或其藥學(xué)上可接受的鹽添加至HCV感染培養(yǎng)細(xì)胞中，能夠促進(jìn)感染性HCV顆粒的形成、以及增強(qiáng)產(chǎn)生；另外，通過在該HCV顆粒形成促進(jìn)劑和抗HCV藥物候選物質(zhì)的存在下培養(yǎng)HCV感染細(xì)胞，能夠?qū)笻CV藥物候選物質(zhì)進(jìn)行評價(jià)；進(jìn)而，使用通過HCV顆粒產(chǎn)生增強(qiáng)方法產(chǎn)生的HCV顆粒而制造HCV疫苗。
【IPC分類】C12N15/09, C12N7/02, A61P31/14, C12Q1/02, A61K39/29, C12N7/06
【公開號(hào)】CN105164251
【申請?zhí)枴緾N201380062187
【發(fā)明人】堀田博, 青木千惠, 脅田隆字, S.普拉蒂維, S.拉特納, H.魯克曼, K.利奧納杜斯
【申請人】國立大學(xué)法人神戶大學(xué), 東麗株式會(huì)社, 公益財(cái)團(tuán)法人東京都醫(yī)學(xué)綜合研究所, 印度尼西亞大學(xué), 印度尼西亞科學(xué)院（Lipi）
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2013年9月27日
【公告號(hào)】CA2886336A1, EP2902485A1, US20150258189, WO2014051111A1