、dAbs，小抗體、納米抗體、 F油-scFv融合體、雙特異性（scFv)4-IgG和雙特異性（scFv)2-F油（參見例如Hu等，Cancer Res. 56 :3055-3061，1996;Atwell等，MolecularImmunology33 :1301-1312,1996 ;Ca;rter 和Merch曰nt，Curr.Opin.Biotechnol. 8 :449-454,1997;Zuo等，ProteinEngineering13 ： 361-367, 2000 ;W及Lu等，J.Immunol.Methods267 :213-226, 2002)。
[0049] 本文所用術(shù)語"免疫球蛋白"指由一種或多種多膚組成的蛋白，所述一種或多種多 膚基本由免疫球蛋白基因編碼。免疫球蛋白的一種形式構(gòu)成了脊椎動(dòng)物中天然（即自然） 抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。該形式是四聚體且由兩個(gè)相同的免疫球蛋白鏈的對組成，各對具有 一條輕鏈和一條重鏈。在各對中，輕鏈和重鏈可變區(qū)（化和VH)共同主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，且 恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)抗體效應(yīng)功能。在較高等的脊椎動(dòng)物中已鑒定到了五種類別的免疫球蛋白 (1邑6、1邑4、1邑1、1曲和1姐）。1邑6是主要類別；其通常^血漿中發(fā)現(xiàn)的第二豐富蛋白的形式 存在。人中，IgG由四個(gè)稱為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的亞類組成。IgG類的重鏈恒定區(qū)被 確定為希臘字母丫。例如，IgGl亞類的免疫球蛋白含有丫 1重鏈恒定區(qū)。各免疫球蛋白重 鏈都具有由恒定區(qū)蛋白結(jié)構(gòu)域（CH1、較鏈、C肥和C冊；IgG3還含有CH4結(jié)構(gòu)域）組成的恒 定區(qū)，所述恒定區(qū)蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)τ谀澄锓N中給定的亞類而言基本不變。編碼人和非人免疫 球蛋白鏈的DNA序列為本領(lǐng)域熟知。（參見例如Ellison等，DNA1 1981;Ellison 等，NucleicAcidsRes. 10 :4071-4079,1982;Kenten等，Proc.化tl.Acad.Sci.USA79 : 6661-6665,1982;Seno等，Nuc.AcidsRes. 11 :719-726, 1983;Riechmann等，Nature 332 :323-327,1988 ;Amste;r等，Nuc.AcidsRes. 8 :2055-2065,1980;Rusconi和Kohler, 化 1:ure3l4:33〇-3；34,1985;Boss等，Nuc.AcidsRes. 12:3791-3806,1984;Bothwell等， 化 1:ure298:380-382,1982;vanderLoo等，Immunogenetics42:333-341，1995 ;Ka;rlin等，J.Mol.Evol. 22 :195-208,1985;Kindsvogel等，DNAl:335-：M3,1982;Breiner等，Gene 18 :165-174,1982;Kondo等，Eur.J.Immunol. 23 :245-249,1993 ;W及GenBank登錄號 J00228)。對于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能的綜述，參見化tnam，ThePlasmaProteins(《血漿 蛋白質(zhì)》），卷V，學(xué)術(shù)出版社公司（AcademicPress,Inc. )，49-140,1987 及化dlan，Mol. Immunol. 31 :169-217,1994。術(shù)語"免疫球蛋白"在本文中W其常用含義使用，指完整的抗 體、其組成鏈或鏈的片段（取決于上下文）。
[0050] 全長免疫球蛋白"輕鏈"（約25kDa或214個(gè)氨基酸）在氨基末端處由可變區(qū)基 因編碼（編碼約110個(gè)氨基酸）且在簇基末端處由K或A恒定區(qū)基因編碼。全長免疫 球蛋白"重鏈"（約50Kd或446個(gè)氨基酸）由可變區(qū)基因（編碼約116個(gè)氨基酸）和丫、 y、a、5或e恒定區(qū)基因（編碼約330個(gè)氨基酸）編碼，后者分別將抗體的同種型限定 為IgG、IgM、IgA、I曲或I姐。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過約12或更多個(gè)氨基 酸的"J"區(qū)接合，其中重鏈還包含約10或更多個(gè)氨基酸的"D"區(qū)（通常參見化ndamental Immunology(《基礎(chǔ)免疫學(xué)》）（Paul編，雷文出版社（RavenPress),紐約，第2版，1989)第 7章）。
[0051] 免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)（在本文中也分別稱為"輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域化 結(jié)構(gòu)域"）或"重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域"（"VH結(jié)構(gòu)域"））由被S個(gè)高變區(qū)（也稱為"互補(bǔ)決定 區(qū)"或"CDR")間斷的"框架"區(qū)組成?？蚣軈^(qū)的功能是將用于特異性結(jié)合的CDR與抗原 的表位對齊。因此，術(shù)語"高變區(qū)"或"CDR"指主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。 從氨基末端至簇基末端，化和VH結(jié)構(gòu)域都包含W下框架區(qū)（FR)和CDR區(qū)：FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各結(jié)構(gòu)域氨基酸的分配與K油at,SequencesofProteinsof ImmunologicalInterest(《免疫學(xué)感興趣蛋白的序列》）（馬里蘭州貝塞斯達(dá)的國立衛(wèi)生 研究院（化tionalInstitutesofHealth) (1987 和 1991))或Qiothia和Lesk，J.Mol. Biol. 196:901-917(1987);Chothia等，化Uire342:878-883(1989)的定義一致。K油at 還提供了廣泛使用的編號慣例化abat編號），其中為不同重鏈之間或不同輕鏈之間相應(yīng)的 殘基分配了相同的編號?；Y(jié)構(gòu)域的CDRU2和3在本文中還分別稱作CDR-LUCDR-L2和 CDR-L3 ;VH結(jié)構(gòu)域的CDRU2和3在本文中還分別稱作CDR-H1、CDR-肥和CDR-冊。
[0052] 除非上下文另有說明，否則本文所用術(shù)語"單克隆抗體"不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn) 生的抗體。術(shù)語"單克隆抗體"指衍生自單個(gè)克隆，包括真核、原核或隧菌體克隆的抗體，而 非其產(chǎn)生方法。
[0053] 術(shù)語"嵌合抗體"是指具有衍生自第一物種的可變結(jié)構(gòu)域和衍生自第二物種的恒 定區(qū)的抗體。例如，可通過遺傳工程由屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建嵌合免疫 球蛋白或抗體。下文定義的術(shù)語"人源化抗體"并不旨在包括嵌合抗體。如本文所述，雖然 人源化抗體在其構(gòu)建中是嵌合的（即，包含來自超過一個(gè)物種的蛋白的區(qū)域），但是它們包 括其他未在嵌合免疫球蛋白或抗體中發(fā)現(xiàn)的特征（即，包括供體CDR殘基和受體框架殘基 的可變區(qū)）。
[0054] 術(shù)語"人源化VH結(jié)構(gòu)域"或"人源化化結(jié)構(gòu)域"指包含完全或基本來自非人供體 免疫球蛋白（如小鼠或大鼠）的一些或全部CDR和完全或基本來自人免疫球蛋白序列的可 變區(qū)框架序列的免疫球蛋白VH或化結(jié)構(gòu)域。提供CDR的非人免疫球蛋白稱作"供體"且 提供框架區(qū)的人免疫球蛋白稱作"受體"。在一些情況下，人源化抗體會(huì)保留人可變結(jié)構(gòu)域 框架區(qū)內(nèi)的一些非人殘基W增強(qiáng)適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特性（例如，當(dāng)抗體是人源化的時(shí)候，需要框 架區(qū)中的突變W保留結(jié)合親和力）。
[00巧]"人源化抗體"是包含人源化VH結(jié)構(gòu)域和人源化化結(jié)構(gòu)域之一或全部兩個(gè)的抗 體。無需存在免疫球蛋白恒定區(qū)，但如果存在，其完全或基本來自于人免疫球蛋白恒定區(qū)。
[0056] 人源化抗體中CD護(hù)基本來自"非人抗體中相應(yīng)CDR的前提是至少60 %、至少85 %、 至少90%、至少95%或100%的相應(yīng)殘基（由K油at所定義）在各CDR之間相同。在其中 各CDR基本都來自非人免疫球蛋白的人源化VH或化結(jié)構(gòu)域的特定變化形式中，相對于相 應(yīng)非人VH或化CDR，人源化VH或化結(jié)構(gòu)域的CDR在全部S個(gè)CDR中具有不超過六個(gè)（例 如不超過五個(gè)、不超過四個(gè)、不超過=個(gè)、不超過兩個(gè)或不超過一個(gè)）氨基酸取代?？贵wVH 或VL結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)框架序列或免疫球蛋白恒定區(qū)的序列（如果存在）分別"基本來自" 人VH或化框架區(qū)序列或人恒定區(qū)的前提是至少85%、至少90%、至少95%或100%的相 應(yīng)殘基（由K油at所定義）是相同的。因此，可能除CDR外，人源化抗體的所有部分都全部 或基本來自天然人免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分。
[0057]抗體與其目標(biāo)抗原的特異性結(jié)合指親和力為至少106、10\ 108、109或10 1。特異 性結(jié)合在幅度上可檢測地高于與至少一個(gè)不相關(guān)祀標(biāo)之間的非特異性結(jié)合并可與之區(qū)分。 特異性結(jié)合可W是特定空間擬合（如鎖和鑰匙類型）或特定官能團(tuán)之間鍵形成的結(jié)果，而 非特異性結(jié)合通常是范德華力的結(jié)果。然而，特異性結(jié)合并不必然表示單克隆抗體結(jié)合一 個(gè)且僅結(jié)合一個(gè)祀標(biāo)。
[005引關(guān)于本文所述的蛋白，與SEQIDNO所指定氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸殘基包括運(yùn) 類殘基的翻譯后修飾。
[0059] 在本文所述的抗體-藥物偶聯(lián)物制劑的內(nèi)容中，"穩(wěn)定化"是指其中的抗體-藥 物偶聯(lián)物在儲(chǔ)存后基本保留其物理和化學(xué)相同性和完整性。本領(lǐng)域中可使用多種測定 蛋白穩(wěn)定性的分析技術(shù)（參見例如《膚和蛋白質(zhì)藥物遞送》（P巧tideandProteinDrug Deliveiy) ,247-301，VincentLee編，MC公司（MarcelDekker，Inc.)，紐約州紐約出版 (1991)和Jones,A.Adv.DrugDeliveryRev. 10 :29-90,1993)。本文也描述了用于測定蛋 白穩(wěn)定性的示例性技術(shù)（參見下面的實(shí)施例）?？蒞在所選溫度下儲(chǔ)存所選時(shí)間，W測定穩(wěn) 定性。對于快速測量，該制劑可保持在較高或"加速"的溫度下，例如，40°C保持1周至1個(gè) 月或更長時(shí)間，其間測量穩(wěn)定性。在示例性實(shí)施方式中，該制劑難W形成組分抗體蛋白的副 產(chǎn)物，例如，高分子量聚集產(chǎn)物、低分子量聚集產(chǎn)物或片段化產(chǎn)物、酸性物質(zhì)、化學(xué)降解產(chǎn)物 或其混合物。術(shù)語"穩(wěn)定性"是指分子物質(zhì)如抗體保留其原始化學(xué)特性（例如，一級、二級 和/或S級結(jié)構(gòu)）的時(shí)間長度。
[0060] 術(shù)語"副產(chǎn)物"包括不需要的產(chǎn)物，其降低或減少給定制劑中治療性抗體-藥物偶 聯(lián)物的比例。一般的副產(chǎn)物包括抗體-藥物偶聯(lián)物的聚集體、抗體-藥物偶聯(lián)物的片段（例 如，由藥物-接頭的脫酷胺、或水解或化學(xué)降解和片段化導(dǎo)致的抗體蛋白的降解產(chǎn)生）、抗 體-藥物偶聯(lián)物的酸性變體或其混合物。
[0061] 抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC)是一般通過接頭與細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)的抗體。接頭可包 括可切割單元或者可能是不可切割的?？汕懈顔卧?，例如含有可通過二硫交換切割的 接頭的二硫化物，可在酸性抑下切割的對酸不穩(wěn)定接頭，和可由水解酶（例如，糖基水解酶 如葡糖醒酸糖巧酶）、醋酶和膚酶（例如，膚接頭和葡糖巧酸接頭）切割的接頭。不可切割 接頭被認(rèn)為通過蛋白水解抗體降解機(jī)制釋放藥物。
[0062] 術(shù)語"高分子量聚集體"包括抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC)的聚集體，W及包含ADC片 段的聚集體（例如，由多膚的降解所產(chǎn)生，例如通過水解）化及包含ADC和運(yùn)類片段的混合 物的聚集體。可通過例如尺寸排阻色譜（SEC)確定高分子量聚集體的存在。一般地，高分 子量聚集體是分子量超過治療性單體ADC的復(fù)合物。對于其中抗體組分是由2對相同的免 疫球蛋白鏈組成的四聚體的ADC(各對具有一條輕鏈和一條重鏈（例如，IgG同種型的））， 運(yùn)類聚集體超過約150kD。然而，對于其中抗體組分的分子量大于或小于一般的單特異性、 四聚體抗體蛋白（由2條免疫球蛋白輕鏈和2條免疫球蛋白重鏈組成（例如，單鏈抗體或 雙特異性抗體））的ADC，運(yùn)類聚集體的大小可相應(yīng)變化。
[0063] 術(shù)語"低分子量降解產(chǎn)物"包括，例如，抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC)的片段，諸如由脫 酷胺或水解生成的片段?？赏ㄟ^例如尺寸排阻色譜（SEC)確定低分子量降解產(chǎn)物的存在。 一般而言，低分子量降解產(chǎn)物的分子量低于治療性單體ADC。對于其中抗體組分是由2對相 同的免疫球蛋白鏈組成的四聚體（各對具有一條輕鏈和一條重鏈（例如，IgG同種型的）） 的ADC，運(yùn)類降解產(chǎn)物低于約150kD。然而，對于其中抗體組分的分子量大于或小于一般的 單特異性、四聚體抗體蛋白（由2條免疫球蛋白輕鏈和2條免疫球蛋白重鏈組成（例如，單 鏈抗體或雙特異性抗體））的ADC，運(yùn)類降解產(chǎn)物的大小可相應(yīng)變化。
[0064] 感興趣的抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC)的"酸性變體"是比ADC的實(shí)驗(yàn)性PI更偏酸性 的ADC變體。可通過例如陽離子交換色譜或成像毛細(xì)管IEF(icIE巧確定酸性變體的存在。 酸性變體的示例是脫酷胺的變體。蛋白分子的脫酷胺變體中一個(gè)或多個(gè)中性酷胺側(cè)鏈被轉(zhuǎn) 化為具有整體酸性特征的殘基（例如，原始多膚的一個(gè)或多個(gè)天冬酷胺殘基被轉(zhuǎn)化成天冬 氨酸）。
[0065] 本文使用的術(shù)語"稀釋劑"是指適用于改變或達(dá)到本文所述的示例性或合適濃度 的溶液。
[0066] 術(shù)語"容器"是指其中可放置或包含物體或液體例如用于儲(chǔ)存的東西（例如，盛放 器、容器、器皿等）。
[0067] 術(shù)語"給藥途徑"包括用于遞送治療性蛋白的本領(lǐng)域公認(rèn)的給藥途徑，例如，胃腸 夕F、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。對于用于治療癌癥的ADC的給藥，可能需要通過靜脈內(nèi)或皮下給 藥來向全身循環(huán)中給藥。對于由實(shí)體瘤表征的癌癥的治療，如果需要，可直接對腫瘤進(jìn)行局 部給藥。
[0068] 術(shù)語"治療"是指向患病的患者給予治療劑，目的在于治愈、愈合、緩解、延緩、釋 放、改變、補(bǔ)救、減輕、改善或影響疾病。
[0069] 術(shù)語"患者"包括接受預(yù)防性或治療性治療的人和其他哺乳動(dòng)物對象。
[0070] 術(shù)語"有效量"或"有效劑量"是指足W實(shí)現(xiàn)或至少部分實(shí)現(xiàn)所需效果的量，即足 W抑制疾病或病癥的一種或多種癥狀的出現(xiàn)或使其緩解的量。有效方案"給予有效量 的藥物組合物。術(shù)語"有效方案"指適于實(shí)現(xiàn)對疾病的預(yù)防性或治療性治療的劑量頻率和 給予的組合物量的組合。
[0071] 本文所用的術(shù)語"劑量單位形式"（或"單位劑型"）是指對于待治療的患者而言適 合用作單一劑量的物理離散單位，各單位含有預(yù)定量的活性化合物（本發(fā)明所述的ADC)， 其經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生與所需的藥物運(yùn)載體、稀釋劑或賦形劑關(guān)聯(lián)的所需治療效果。本發(fā)明中劑量 單位形式的規(guī)格取決于或直接依賴于活性化合物的獨(dú)特特性和待實(shí)現(xiàn)的具體治療效果，W 及復(fù)合運(yùn)種活性化合物用于治療患者的領(lǐng)域中的固有限制。
[0072] 可改變本發(fā)明的制劑中ADC的實(shí)際劑量水平，從而獲得就具體患者、組合物與給 藥方式有效實(shí)現(xiàn)所需治療應(yīng)答且對患者無毒性的ADC的量。所選劑量水平取決于多種藥代 動(dòng)力學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明特定組合物的活性，給藥途徑，給藥時(shí)間，所用特定化合物 的排泄率，治療持續(xù)時(shí)間，與所用特定組合物聯(lián)用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療 病人的年齡、性別、體重、病癥、整體健康狀況、先前病史化及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的類似因素。
[0073]"細(xì)胞毒性效果"指祀標(biāo)細(xì)胞的缺失、消除和/或死亡。"細(xì)胞毒劑"指對細(xì)胞有細(xì) 胞毒性效果的試劑。
[0074]"細(xì)胞生長抑制效果"指細(xì)胞增殖的抑制。"細(xì)胞生長抑制劑"指對細(xì)胞具有細(xì)胞 生長抑制效果，從而抑制細(xì)胞的特定子集生長和/或擴(kuò)增的試劑。
[00巧]如果W最大對應(yīng)性進(jìn)行比對時(shí)兩種氨基酸序列的氨基酸殘基是相同的，則運(yùn)兩種 氨基酸序列具有"100%氨基酸序列相同性"?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)軟件程序（如DNASTAR公司（威 斯康星州麥迪遜）生產(chǎn)的LASERGE肥生物信息學(xué)計(jì)算套件中包括的那些）來進(jìn)行序列比 較。用于通過確定最佳比對來比較兩種核巧酸或氨基酸序列的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的。（參見例如Peruski和F^eruski，HieInternetandtheNewBiology:Tools 化rGenomicandMolecularResearch《因特網(wǎng)和新生物學(xué)：用于基因組和分子研究的 工具》）（ASM出版社公司，1997);Wu等（編），"Info;rmationSuperhi曲wayandComputer Dat油asesofNucleicAcidsandProteins(《核酸和蛋白質(zhì)的信息超高速公路和計(jì)算機(jī) 數(shù)據(jù)庫》）"刊于MethodsinGeneBiotechnology(《基因生物技術(shù)方法》）123-151 (CRC出 版社公司，1997)巧ishop(編），GuidetoHumanGenomeComputing(《人基因組計(jì)算指南》） (第2版，學(xué)術(shù)出版社公司，1998)。）如果兩條氨基酸序列相對彼此至少80%、至少85%、 至少90%或至少95%相同，則認(rèn)為運(yùn)兩條序列具有"大體序列相同性"。
[0076] 通過K油at編號慣例對抗體序列進(jìn)行最大程度的比對W確定序列相同性百分比。 比對后，如果比較的是對象抗體區(qū)域（如重鏈或輕鏈的整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域）與參考抗體的相 同區(qū)域，則對象和參考抗體區(qū)域之間的序列相同性百分比為對象和參考抗體區(qū)域中被相同 氨基酸所占據(jù)的位置數(shù)目除W兩個(gè)區(qū)域經(jīng)排列位置的總數(shù)，不計(jì)算缺口，乘W100W轉(zhuǎn)化 為百分?jǐn)?shù)。
[0077] 術(shù)語"藥物制劑"指此類形式的制劑：所述制劑允許其中所含活性成分的生物學(xué)活 性有效（當(dāng)給予對象時(shí)），并且不含對于待給予該制劑的對象而言具有不可接受毒性的額 外成分。運(yùn)類制劑是無菌的。
[0078]"包含"一種或多種所列元素的組合物或方法可包含未特別列出的其他元素。
[0079] 本文中設(shè)及數(shù)值范圍（例如，"X至Y"或"從X至Y")包括限定范圍的端點(diǎn)和落 入該范圍的所有值。
[0080] 除非上下文中另有明確說明，當(dāng)某一數(shù)值表達(dá)為"約"X或"大約"X時(shí)，所示X的 數(shù)值應(yīng)理解為精確至± 10 %。
[0081] 實(shí)施方式描述
[0082] 苯并二氮雜韋抗體-藥物偶聯(lián)物
[0083] 苯并二氮雜_草抗體-藥物偶聯(lián)物是指一般但不必須通過接頭與苯并二氮雜孽二 聚體偶聯(lián)的抗體。苯并二氮雜草藥物-接頭是指與接頭連接的苯并二氮雜掌二聚體。苯并 二氮雜覃藥物-接頭的接頭組分一般將具有用于與抗體連接的反應(yīng)性基團(tuán)。苯并二氮雜羣 化合物在其核屯、中具有與二氮雜掌環(huán)稠合的苯環(huán)。與二氮雜掌環(huán)稠合的苯環(huán)的示例性環(huán)結(jié) 構(gòu)如下：
[0084]
[0085] 苯并二氮雜孽化合物在兩個(gè)環(huán)上取代基的位置、類型和數(shù)量上并且在二氮雜草環(huán) 的飽和度上不同。它們也在與苯和/或二氮雜草環(huán)稠合的其他環(huán)的數(shù)量上不同。苯并二 氮雜草化合物的定義包括苯環(huán)或二氮雜孽環(huán)與一個(gè)或多個(gè)芳族或非芳族碳環(huán)或雜環(huán)稠合。 苯并二氮雜掌二聚體是已經(jīng)通過聯(lián)接臂（tether)聯(lián)接兩個(gè)苯并二氮雜掌單元形成的化合 物。
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