是本領域熟知的并且不在本文中詳細 描述。用于本發(fā)明的抗體可W是完整的抗體或其抗原結合片段。優(yōu)選的抗體是人或人源化 抗體，具體是人或人源化單克隆抗體。在一些方面中，該抗體將特異性結合在癌細胞表面上 表達的癌細胞抗原。在其他方面中，抗體將結合與自身免疫疾病狀態(tài)關聯的激活的淋己細 胞。在一些方面中，該抗體會特異性結合CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、憐脂酷肌醇蛋白聚 糖-3、LiV-1 或LewisY抗原。
[0145] 在具體的實施方式中，抗體是特異性結合人CD33的胞外結構域的抗-CD33抗體。 示例性人CD33序列對應Swiss-Prot登錄號P20138。在某些實施方式中，抗-CD33抗體包 含命名為2H12的鼠抗-CD33單克隆抗體的輕鏈和/或重鏈可變結構域互補決定區(qū)（分別是 SEQIDNO:1和2中顯示的化和VH結構域氨基酸序列）。因此，在一些變體中，抗-CD33 抗體的輕鏈可變（VL)結構域包含SEQIDNO:5所示的CDR-L1氨基酸序列、SEQIDNO:6 所示的CDR-L2氨基酸序列和SEQIDNO:7所示的CDR-L3氨基酸序列；和/或其重鏈可變 (VH)結構域包含SEQIDNO:8所示的CDR-H1氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的CDR-肥氨 基酸序列和SEQIDNO:10所示的CDR-冊氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗-CD33抗 體是人源化抗體。例如，在包含上述的化和/或VH結構域的抗-CD33抗體的某些變化中， 化結構域是衍生自具有SEQID: 1所示的氨基酸序列的鼠2H12化結構域的人源化化結構 域，和/或VH結構域是衍生自具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的鼠2H12VH結構域的 人源化VH結構域。特別合適的化和VH結構域的氨基酸序列分別與SEQIDNO:3和SEQ IDNO:4至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或100%相同。在某些實施方式中，抗-CD33抗體包括第一和第二多膚鏈， 其中第一多膚鏈包含在與簇基末端與輕鏈恒定區(qū)（例如，具有SEQIDNO:21的氨基酸序列 的輕鏈恒定區(qū)）融合的化結構域并且第二多膚鏈包含在其簇基末端與重鏈恒定區(qū)（例如， 具有SEQIDNO或SEQIDNO:23的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)）融合的VH結構域。在 運類變化中，抗-CD33抗體一般是由兩對相同的免疫球蛋白鏈組成的四聚體，各對具有一 條輕鏈和一條重鏈。適用于本發(fā)明的示例性抗-CD33抗體也描述于2012年5月18日提交 的美國臨時申請?zhí)?1/649, 110,其內容通過引用全文納入本文用于所有目的。
[0146] 在其他實施方式中，抗體是特異性結合人CD70的胞外結構域的抗-CD70抗體。示 例性人CD70序列對應Swiss-Prot登錄號P32970. 2。在某些實施方式中，抗-CD70抗體包 含命名為1F6的鼠抗-CD70單克隆抗體的輕鏈和/或重鏈可變結構域互補決定區(qū)（分別是 SEQIDNO:11和12中顯示的化和VH結構域氨基酸序列）。在一些運類變體中，抗-CD70 抗體的輕鏈可變（VL)結構域包含SEQIDN0:15所示的CDR-L1氨基酸序列、SEQIDNO: 16所示的CDR-L2氨基酸序列和SEQIDNO:17所示的CDR-L3氨基酸序列；且其重鏈可變 (VH)結構域包含SEQIDNO:18所示的CDR-H1氨基酸序列、SEQIDNO:19所示的CDR-肥 氨基酸序列和SEQIDNO:20所示的CDR-冊氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗-CD70抗 體是人源化抗體。例如，在包含上述的化和/或VH結構域的抗-CD70抗體的某些變化中， 化結構域是衍生自具有SEQID: 11所示的氨基酸序列的鼠W6化結構域的人源化化結構 域，和/或VH結構域是衍生自具有SEQIDNO: 12所示的氨基酸序列的鼠1F6VH結構域的 人源化VH結構域。特別合適的化和VH結構域的氨基酸序列分別與SEQIDNO:13和SEQ IDNO: 14至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至 少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %相同。在某些實施方式中，抗-CD70抗體包括第一和 第二多膚鏈，其中第一多膚鏈包含在與簇基末端與輕鏈恒定區(qū)融合的化結構域（例如，具 有SEQIDNO:21的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)）并且第二多膚鏈包含在其簇基末端與重鏈 恒定區(qū)融合的VH結構域（例如，具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)）。在運 類變化中，抗-CD70抗體一般是由兩對相同的免疫球蛋白鏈組成的四聚體，各對具有一條 輕鏈和一條重鏈。適用于本發(fā)明的示例性抗-CD70抗體也描述于美國專利號8, 067, 546,其 內容通過引用全文納入本文用于所有目的。
[0147] 示例性的抗-CD33和抗-CD70可變結構域和CDR序列，W及示例性免疫球蛋白輕 鏈和重鏈恒定區(qū)示于下表1。
[014引 表1
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]
[0153] 如前所述，本發(fā)明的示例性藥物制劑顯示（i)與制劑中含0.5%w/v或更低環(huán)糊 精的制劑相比降低的聚集速率和程度，（ii)與不含環(huán)糊精的制劑相比減緩的酸性物質增加 和/或（iU)與制劑中含2%w/v或更低環(huán)糊精的制劑相比藥物-接頭（例如，苯并二氮 雜孽藥物）的化學降解減少。因此，本發(fā)明提供了制備制劑的方法，該制劑具有W下中的至 少一種：（i)與制劑中含2%w/v或更低環(huán)糊精的制劑相比改善的對苯并二氮雜掌藥物的化 學降解的耐性，（ii)與制劑中含0. 5%w/v環(huán)糊精或更低的制劑相比改善的對聚集的耐性， 和（iii)與不含環(huán)糊精的制劑相比改善的對酸性物質增加的耐性。因此，在一些方面中，包 含約5%或約6%w/v或更高環(huán)糊精的本發(fā)明的藥物制劑顯示W下至少一種：（i)與制劑中 含2%或更低環(huán)糊精的制劑相比改善的對苯并二氮雜韋藥物的化學降解的耐性，（ii)與制 劑中含0.5%或更低環(huán)糊精的制劑相比改善的對聚集的耐性，和（iii)與不含環(huán)糊精的制 劑相比改善的對酸性物質增加的耐性。因此，在一些方面中，包含約5%或約6%w/v或更 高環(huán)糊精的本發(fā)明的藥物制劑顯示（i)與制劑中含2%w/v或更低環(huán)糊精的制劑相比改善 的對苯并二氮雜_寧藥物的化學降解的耐性W及（ii)與制劑中含0.5%w/v或更低環(huán)糊精 的制劑相比改善的對聚集的耐性。在其他方面中，包含約5%或約6%w/v或更高環(huán)糊精的 本發(fā)明的藥物制劑顯示（i)與制劑中含2%或更低環(huán)糊精的制劑相比改善的對苯并二氮雜 藥物的化學降解的耐性，（ii)與制劑中含0.5%或更低環(huán)糊精的制劑相比改善的對聚集 的耐性，和（iii)與不含環(huán)糊精的制劑相比改善的對酸性物質增加的耐性。
[0154] 在本文所述的任意制劑或混合物（包括藥物制劑）中，如本文所述，苯并二氮雜草 ADC可包含與P抓二聚體1、P抓二聚體2、P抓二聚體3、P抓二聚體4、P抓二聚體5、P抓二 聚體6、P抓二聚體7、P抓二聚體8、P抓二聚體9、P抓二聚體10、P抓二聚體11、P抓二聚 體12、P抓二聚體13、P抓二聚體14、P抓二聚體15、P抓二聚體16或P抓二聚體17偶聯 的人源化2H12或人源化1F6抗體。在一些方面中，P抓二聚體將通過經工程改造到抗體中 的半脫氨酸殘基與抗體偶聯。在一些方面中，半脫氨酸殘基在由抓索引化油at,Sequences ofProteinsofImmunologicalInterest(《免疫學感興趣的蛋白質的序列》）（馬里蘭州 貝塞斯達的國立衛(wèi)生研究院，1987和1991))確定的239位（人IgGl)處工程改造到抗體 中。在一些方面中，制劑中每個抗體將有平均2個藥物-接頭。
[01巧]在一些實施方式中，本發(fā)明的藥物制劑提供了ADC(例如，抗-CD33或抗-CD70ADC) 的濃縮制劑，通常用作原料藥產品。此外，在某些實施方式中，本發(fā)明的藥物制劑對冷凍、凍 干和/或重建穩(wěn)定。
[0156] 在一些方面中，本文所述的藥物制劑儲存在約-80°C至約8°C的溫度下。通常，在 運些范圍內，藥物制劑是穩(wěn)定的并且保持生物活性。在某些方面中，當暴露于脅迫條件（例 如，在25°C或40°C下儲存延長的時間，如7天和14天）時，與不含環(huán)糊精的制劑相比，本文 所述的制劑具有改善的穩(wěn)定性。
[0157] 本發(fā)明的藥物制劑適用于通過多種給藥途徑遞送。在某些實施方式中，通過胃腸 夕F，如靜脈內、肌內或皮下給予藥物制劑。對于用于治療癌癥的ADC的給藥，可通過靜脈內 或皮下給藥來向全身循環(huán)中遞送藥物制劑。在具體的實施方式中，配制藥物制劑用于靜脈 內遞送。靜脈內給藥可W是例如輸注一段時間（如30-90分鐘）或單次推注注射。在一些 方面中，將通過在外周插入的中央導管中的緩慢的靜脈內推注（即超過30-60秒）來給藥。
[0158] 本發(fā)明的藥物制劑的有效劑量可根據許多不同的因素變化，包括給藥方式、目標 位點、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動物、給予的其他藥物和治療是預防性還是治療性。 通常，患者是人，但也可治療非人哺乳動物。需要對治療劑量進行滴定W優(yōu)化安全性和功 效。
[0159] 本發(fā)明的ADC制劑的示例性劑量包括約1. 0 y g/kg至約5mg/kg、約10 y g/kg至約 3mg/kg、約10 y g/kg至約2mg/kg、約1. 0 y g/kg至1. Omg/kg或約1. 0 y g/kg至500. 0 y g/ kg對象體重。
[0160] 給藥頻率取決于抗體-藥物偶聯物在循環(huán)中的半衰期、患者的病癥和給藥途徑等 因素。該頻率可W是響應患者病癥的變化或所治療病癥（例如，癌癥）的進展進行每天、每 周、每月、每季度或不規(guī)則間隔給藥。在一段持續(xù)治療過程中，靜脈內給藥的一個示例性頻 率為介于一周兩次和每季度一次之間，但也可采用更高或更低頻率的劑量。在一段持續(xù)治 療過程中，靜脈內給藥的其他示例性頻率為介于一周一次和每月一次之間，但也可采用更 高或更低頻率的劑量。對于皮下給藥，示例性劑量頻率為每天至每月，但也可采用更高或更 低頻率的劑量。
[0161] 尤其優(yōu)選的是單位劑型形式的本發(fā)明的制劑W便于劑量的均勻和給藥。本發(fā)明的 制劑可W液體或凍干形式存在于例如，膠囊、玻璃瓶、安飯、多劑量容器等中。單位劑型可包 括本文所述的任意制劑。在一些方面中，ADC會是儲存于一次性班巧色玻璃瓶中用于靜脈內 給藥重建的凍干餅或粉末。重建使用合適的稀釋劑（例如，注射用水）至所需的濃度。通 常用足量的稀釋劑來進行重建，使得重建的溶液的組分濃度通常與凍干前的制劑相同。根 據待給予患者的劑量水平，還可進一步稀釋重建產物。進一步稀釋可使用，例如，注射用氯 化鋼。在本發(fā)明的一些方面中，在重建或任選的進一步稀釋之后，立即通過靜脈內（例如， 緩慢靜脈內推注）向中央靜脈可及裝置的合適注射部分給予ADC。通常用鹽水沖洗輸注線。
[0162] 在一些方面中，本發(fā)明提供了包含藥物單位劑型的治療產品，該劑型包含本發(fā)明 的穩(wěn)定化ADC制劑（例如，如本文所述，含液體或凍干形式的ADC制劑的密封容器）。治療 產品還可包含使用標簽。在一些實施方式中，W藥盒形式提供的治療產品還包含，例如，使 用在患者中達到治療劑量所必需的合適體積的說明。可設計單位劑型、容器或藥盒W提供 多次使用的足夠制劑或用于單次使用。在一些實施方式中，該藥盒還包含稀釋劑。
[016引如果不同版本的序列在不同的時間與一個登錄號相關，則表示在本申請的有效申 請日與該登錄號相關的版本。有效申請日表示早于實際申請日或關于該登錄號的一項優(yōu)選 權申請的申請日（如果適用）。類似地，如果不同版本的出版物在不同時間公開，除非另有 說明，否則表示與本申請的有效申請日最接近時間公開的版本。除非另有特定說明，本發(fā)明 中的任意特征、步驟、元件、實施方式或方面均可與任意其他的聯用。雖然出于方便和理解 的目的，通過闡述和舉例的方式詳細描述了本發(fā)明，但可明顯看出，某些改變和修改應屬于 所附權利要求書的范圍。上文和下文中提到的所有專利申請、網頁、其他出版物、登錄號等 均通過引用全文納入本文W用于所有目的，就好像各項均特定和單獨表示通過引用納入本 文。 實施例
[0164]在W02011/130613中描述了P抓二聚體1-4及其合成?？墒褂肳02011/130613 A1中所述的方法來合成P抓二聚體5-10和16。簡而言之，可通過W02011/130613A1中的 C3-連接的雙-S氣甲橫酸醋中間體8a獲得P抓二聚體9和16。所需的C2芳基基團如棚 酸或棚酸頻哪醇醋在隨后的鈴木（Suzuki)偶聯中被引入，之后是沈M雙內酷胺還原W展 現亞胺官能團。W相同的方式從W02011/130613A1中的C5-連接的雙氣甲橫酸醋中 間體8b制備P抓二聚體5-8和10。可采用W02011/130613A1中所述的方法稍作改動得 到在C2芳基中含醋或簇酸的P抓二聚體11-15。可從W02011/130613A1中的C3-連接的 雙-S氣甲橫酸醋中間體8a制備PBD二聚體13。使用合適的官能化的棚酸或棚酸頻哪醇 醋通過鈴木偶聯對雙-=氣甲橫酸醋去對稱化（desymmetrized)W將C2芳基設置為含有 氨基官能團。然后用S乙基棚氨化裡將所得的單S氣甲橫酸醋還原成沈M甲醇，其然后用 于第二次鈴木偶聯W將C2芳基設置為含有甲醋。最后，如W02011/130613A1所述，通過在 硅膠上攬拌3天將沈M甲醇轉化成亞胺。W相同的方式從W02011/130613A1中的C5-連 接的雙-S氣甲橫酸醋中間體8b制備P抓二聚體12和14?？赏ㄟ^皂化來實現PBD醋向游 離簇酸（11和15)的轉化。在US20100158909中一般地描述了IgGlmAb的半脫氨酸突變體 的制備。
[0165] 在下文實施例中使用的P抓藥物-接頭如下。在W02011/130613A1中描述了藥 物-接頭與抗體的偶聯。
[0166]
[016引下文實施例中提及的巧滅的藥物-接頭具有W下結構：
[0169]
[0170] P抓藥物接頭通過重鏈239位與h2H12ec抗體或hlF6ec偶聯（抗體名稱中"ec" 是指抗體在239位處有經工程改造的半脫氨酸）。簡而言之，在239位（抓索引編碼）處 引入半脫氨酸的h2H12和hlF6經還原，部分再氧化（即，對鏈間二硫鍵的再氧化），并使用 W0 2011/130613中所述的方法偶聯至P抓藥物-接頭W形成ADC。P抓藥物-接頭通過引 入的半脫氨酸殘基偶聯至經部分再氧化的抗體（每抗體平均2個藥物-接頭）。h2化2-1 指與化合物1偶聯的人源化2H12ec抗體，而hlF6-l指與化合物1偶聯的人源化lF6ec抗 體。h2H12-2指與化合物2偶聯的人源化2H12ec抗體，而hlF6-2指與化合物2偶聯的人源 化lF6ec抗體。h2H12-3指與化合物3偶聯的人源化2H12ec抗體，而hlF6-3指與化合物3 偶聯的人源化lF6ec抗體。使用通過239位處引入的半脫氨酸與化合物1偶聯的h2H12ec 或hlF6ec來進行實施例4-7。
[017。 實施例1 :環(huán)糊精基制劑降低了全部6種PBDADC的聚集速率和程度[0172] 通過采用透析、緩沖液交換柱或離屯、過濾將原料緩沖液交換成測試制劑緩沖液來 制備制劑。在【附圖說明】中顯示了制劑。所示的精氨酸濃度為0.5M。由UV光譜確定最終的ADC濃度范圍為1.3mg/mL至3.Img/mL。將配制的ADC填充至預滅菌的管中并在W下ICH 條件下儲存：2-8°C，25°C/65%RH和/或40°C775%RH。使用尺寸排阻色譜來監(jiān)測％曲柳。 圖1制劑含h2化2-1并在25°C下儲存；圖2制劑含hlF6-l并在25°C下儲存；圖3制劑含 h2H12-3并在40°C下儲存；圖4制劑含hlF6-3并在40°C下儲存；圖5制劑含h2化2-2并在 40°C下儲存；圖6制劑含hlF6-2并在40°C下儲存；圖13制劑含hlF6-l并在25°C下儲存。 [017引實施例2 :基于HPBCD的制劑減緩了 6個PBDADC中5個的酸性物質增加。
[0174] 通過采用透析、緩沖液交換柱或離屯、過濾將原料緩沖液交換成測試制劑緩沖液來 制備制劑。在【附圖說明】中顯示了制劑。所示的精氨酸濃度為0.5M。由UV光譜確定最終的ADC濃度范圍為1. 3mg/血至3.Img/血。將制劑填充至預滅菌的管中并在W下ICH條件下 儲存：2-8°C，25°C765%RH和/或40°C775%RH。通過圖像毛細管等電聚焦分析樣品的 電荷分布（酸性％、主要％、堿性％)。圖7制劑含h2H12-l并在25°C下儲存；圖8制劑含 hlF6-l并在25°C下儲存；圖9制劑含h2化2-3并在40°C下儲存；圖10制劑含hlF6-3并在 40°C下儲存；圖11制劑含h2化2-2并在40°C下儲存；圖12制劑含hlF6-2并在40°C下儲 存。
[01巧]實施例3 :基于HPBCD的制劑降低了藥物-接頭的化學降解
[0176] 通過采用透析、緩沖液交換柱或離屯、過濾將原料緩沖液交換成測試制劑緩沖液來 制備制劑。通常，制劑包含作為對照的初始制劑（最常用精氨酸）、緩沖劑、3%環(huán)糊精和6% 環(huán)糊精。由UV光譜確定最終的ADC濃度范圍為1. 3mg/mL至3.Img/mL。將制劑填充至預 滅菌的管中并在W下ICH條件下儲存：2-8°C，25°C765%RH和/或40°C775%RH。通過使 用還原型化RP/MS通過降解產物％或使用胃蛋白酶消化圖通過完整藥物接頭％來測量藥 物-接頭穩(wěn)定性。結果如下，各制劑列于左欄。表2顯示在40°C下一周后含6%環(huán)糊精的制 劑比含2%環(huán)糊精的制劑顯示較少的藥物接頭降解。表3顯示含6%環(huán)糊精的h2H12-l制 劑在25°C下一周后顯示較少的藥物接頭降解并且表4顯示含6%hpb環(huán)糊精的hlF6-l制 劑在40°C下一周后維持較高水平的完整藥物接頭。
[0177]表 2 [017引
[0183] 實施例4 :環(huán)糊精濃度曲線。
[0184] 該實驗測試了 3%w/v的徑丙基-P-環(huán)糊精化pb-CD)作為滲濾緩沖液在滲濾期 間防止包含h2H12-l的巧滅的偶聯反應混合物（QCR)聚集的實用性。該實驗的初步目標是 確定待用于滲濾的膜對于hpb-CD是否是可透的。如果膜對于hpb-CD是弱可透的，則