Dna適配體結合組氨酸標簽及其應用
【專利說明】DNA適配體結合組氨酸標簽及其應用
[0001]下文中描述的本發(fā)明涉及單鏈DNA適配體結合組氨酸標簽的獨特核苷酸序列，及其應用。
[0002]原核細胞和真核細胞常常作為生產重組蛋白的高效表達體系。親和層析法經常被用來獲取滿足純度和質量要求的蛋白質。固定化金屬親和層析法(IMAC)是這種層析法中的一個例子。使用這種技術必須要一個短小的組氨酸標簽(His-tag)融合在目標蛋白質上，其通常含有6個連續(xù)重復的組氨酸殘基。組氨酸標簽能可逆結合在某種金屬離子上(比如，鈷、銅、鎳和鋅)。使用合適的含有上述一種離子的載體，可以保證組氨酸標簽蛋白質的純度或固定。通過采用western blotting蛋白質印跡技術，使用直接針對該標簽的單克隆或多克隆抗體，結合在重組蛋白上的組氨酸標簽可以用來檢測它們。這種蛋白質檢測體系可在其它研究蛋白質之間交互作用的體外技術中使用，比如拉下實驗，免疫共沉淀技術或者Far Western blotting蛋白質檢測印跡技術。
[0003]DNA適配體定義為具有約40-100個核苷酸長度的單鏈脫氧核糖核酸分子，對配體結合有較高的特異性和親和性。該適配體豐富的二級和三級結構，意味著針對分子靶選擇的適配體的匹配度可達到最佳。
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種新的方法來識別包含有組氨酸標簽的分子，特別是通過提供對包含組氨酸標簽的分子靶，或其它包含組氨酸六聚物的分子(比如，肽、蛋白質、DNA衍生品)具有強親和性的新分子來實現(xiàn)。
[0005]上述技術目標可以根據所述的發(fā)明來實現(xiàn)。
[0006]本發(fā)明的主題是對組氨酸標簽具有親和性的DNA適配體，其具有序列編號SEQID.N0.1的下述核苷酸序列:
5’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTCTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3’，下稱“適配體Al”，
或序列編號SEQ ID.N0.2的下述核苷酸序列:
5’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTTTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3’，下稱“適配體BI”。
[0007]本發(fā)明可允許DNA序列的某些變化，只要能保證其對含有組氨酸標簽肽或蛋白質的親和性，也允許在多種蛋白質的混合中對組氨酸標簽蛋白質進行選擇性純化。特別地，本發(fā)明的范圍覆蓋了上述序列的至少在一個嘌呤堿基或嘧啶堿基上不同的變體。
[0008]本發(fā)明的另一個主題是，帶有上文定義的一個DNA序列的寡聚核苷酸，用于制備對包含組氨酸標簽的分子靶具有親和性的分子的用途。
[0009]所述用途可如下:
-作為組氨酸標簽的直接抗體激動劑使用，
-用于檢測包含組氨酸標簽的分子靶，
-用于純化包含組氨酸標簽的分子靶，
-用于結合包含組氨酸標簽的分子靶，
-用于分析包含組氨酸標簽的分子靶的濃度。
[0010]特別地，這些寡聚核苷酸能以帶附加標簽的分子的形式使用，比如使用熒光標簽來標識含有組氨酸標簽的分子靶。
[0011]這類分子能用于，例如通過使用技術人員熟悉的光譜技術，如FRET (熒光共振能量轉移)或BiFC (雙分子熒光互補)，來監(jiān)測蛋白質之間的相互作用。
[0012]下文可以進一步明確本發(fā)明的特征:
圖1所示為一個包含組氨酸標簽的蛋白質與適配體之間的結合。圖列說明:1)蛋白質標記，2)與BI適配體孵育的HiS-PCNA組氨酸-增殖細胞核抗原蛋白質，3)與BI適配體孵育的增殖細胞核抗原蛋白質，4)與一種參照適配體孵育的組氨酸-增殖細胞核抗原蛋白質，5)與一種參照適配體孵育的增殖細胞核抗原蛋白質。對試樣進行SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后對蛋白質進行考馬斯亮藍G-250染色。
[0013]
圖2所示為從一種大腸桿菌蛋白提取物中對組氨酸標簽蛋白的純化。圖列說明:1)蛋白質標記，2)40mg大腸桿菌蛋白提取物，3)在BI適配體幫助下純化的組氨酸-增殖細胞核抗原蛋白。對試樣進行SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后對蛋白質進行考馬斯亮藍G-250染色。
[0014]圖3所示為ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗的結果，其中使用BI適配體來檢測含有組氨酸標簽的重組蛋白。數據所示為三次獨立實驗的平均結果。
[0015]本發(fā)明通過下述實施例進行補充說明。它們并不代表本發(fā)明的所有范圍。
[0016]實施例1.對組氨酸標簽具有親和性的DNA適配體的生成。
[0017]研究對含有組氨酸標簽的分子靶具有親和性DNA分子的生成過程，結果顯示含有下述序列之一的DNA適配體具有強烈的親和性:
5 ’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTCTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3 ’ (序列編號 SEQ ID.N0.1),
5 ’ -GTTTGCCGGTGGGCAGGTTTAGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAGGAACATGCGTCGCAAAC-3，
(序列編號 SEQ ID.N0.2)，
本發(fā)明可用專業(yè)人員熟悉的常規(guī)DNA合成方法來獲取DNA分子。
[0018]提供一個采用固相化學合成技術獲取寡聚核苷酸分子的實施例(扎拉特夫，1.，馬諾哈蘭，M.，瓦瑟爾，J.-J.以及莫爾萬，F(xiàn).5’-三磷酸DNA RNA的固相化學合成，以及化學修飾的寡聚核苷酸.核酸化學的實驗室指南.2012; 50:1.28.1-1.28.16.)
根據上文中定義的序列獲得的適配體Al及A2，長度為60的核苷酸，合成質量分別為64 Img及612mg，通過HPLC高效液相色譜法進行驗證。
[0019]擁有這些序列的DNA分子上可更易進行更多修飾。特別地，可與已知的染料(比如，一些熒光劑)，或其它分子(比如，生物素)聯(lián)合使用。
[0020]生物素化適配體Al及BI的實施例，其質量分別為477mg及459mg，通過生物素化寡聚核苷酸在5’末端自動合成而獲得。(彭，R.T.—種用于亞磷酰胺自動合成5’ -生物素化寡聚核苷酸的長鏈生物素試劑，四面體快訊.1991; 32: 1715 - 1718).產物通過HPLC高效液相色譜法進行驗證。
[0021]實施例2.組氨酸標簽蛋白質與結合色譜樹脂的適配體的結合。
[0022]1ml的50%瓊脂糖耦合鏈霉親合素裝入一個1.5ml Eppendorf埃彭道夫管中，并用蒸餾水沖洗。隨后用BW緩沖液（17. 5 g/L NaCl, 50 mM磷酸鹽緩沖液NaH2P04/Na2HP04，0.1% (v/v)吐溫20，pH 7. 5)沖洗3次。之后，將樹脂浸入300 μ I BW緩沖液中，該緩沖液包含20mg的5’ -生物素化的BI或是其它帶有序列（ACTG) xlO - GAGGAACATGCGTCGCAAAC的參照適配體。試樣在室溫下孵育lh。孵育完成后，用BW緩沖液沖洗樹脂三次，隨后用AS緩沖液（137 mMNaCl, 12. 7 mMKCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, 5 mM MgC12, O. I % (v/v)吐溫20，pH 7. 4)沖洗兩次。最后一次沖洗后，附有結合的適配體的樹脂浸入300 μ I的AS緩沖液中，加入重組的人類增殖細胞核抗原蛋白，到最終濃度為O. 13 mg/ml。在這個實驗中，使用了兩種不同的增殖細胞核抗原蛋白：a)含有組氨酸標簽以及b)不含組氨酸標簽。帶有蛋白的樹脂在室溫下孵育lh。孵育完成后，用AS緩沖液沖洗四次，浸入GLB緩沖液（50 mM Tris-HCl三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，2% SDS (w/v)溴酚藍2% (w/v), 10%甘油，200 mM β-巰基乙醇，pH 6.8)中，并在95°C孵育5min。獲得的試樣進行SDS-PAGE(Laemmli萊姆利法）處理。分離完成后，用考馬斯亮藍G-250對蛋白質進行染色。所得結果如圖I所示。
[0023]實施例3.從蛋白細胞提取物中純化含有組氨酸標簽的蛋白。
[0024]10μ1的50%瓊脂糖耦合鏈霉親合素裝入一個L 5mlEppendorf埃彭道夫管中，并用蒸餾水沖洗。之后，用BW緩沖液（O. 3 M NaCl, NaH2P04/Na2HP04 50 mM磷酸鹽緩沖液，O. I % (v/v)吐溫20，pH 7. 5)沖洗3次。將樹脂浸入300ml BW緩沖液中，該緩沖液包含20mg的5’ -生物素化的適配體BI，試樣在室溫下孵育lh，隨后用BW緩沖液沖洗三次，用AS緩沖液（137 mM NaCl, 12. 3 mM KCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, 5 mM MgC12, O. I% (v/v)吐溫20，pH 7. 4)沖洗兩次。最后一次沖洗后，附有結合的適配體的樹脂浸入300 μ I的AS緩沖液中。之后，從過表達組氨酸-增值增殖細胞核抗原蛋白質的大腸桿菌細胞制備的總蛋白提取物加入，到濃度為2. O mg/ml ο樹脂在室溫下孵育lh。孵育完成后，將樹脂用AS緩沖液沖洗四次。組氨酸-增殖細胞核抗原在洗脫緩沖液（50 mM Tris三羥甲基氨基甲烷，PH 7. 5)作用下洗脫。洗脫后的蛋白質與GLB緩沖液（50 mM Tris，2% SDS(w/v)溴酚藍2% (w/v), 10%甘油，200 mM β-巰基乙醇，pH 6. 8)混合，并在95°C孵育5min。獲得的試樣進行SDS-PAGE (Laemmli法)處理。分離完成后，用考馬斯亮藍G-250對蛋白質進行染色。所得結果如圖2所示。
[0025]實施例4.采用ELISA方法檢測組氨酸標簽蛋白。
[0026]一個96孔ELISA平板上覆蓋人類增殖細胞核抗原蛋白（O. 5mg蛋白質/孔)。在實驗中，使用了兩種不同的增殖細胞核抗原蛋白：a)含有組氨酸標簽以及b)不含組氨酸標簽。該蛋白質在4°C下與平板結合16h。隨后，用PBST緩沖液（lx PBS含有O. 5% (v/v)吐溫20)沖洗ELISA板3次。之后，平板在室溫下靜置在含有2% (w/v)牛血清蛋白的IxPBS緩沖液中2h。接下來，用PBST緩沖液沖洗平板三次，并與5’生物素化BI或參照適配體一起，在 AS 緩沖液（137 mM NaCl, 12. 3 mM KCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, 5 mMMgC12, pH 7.4，0.1% (v/v)吐溫20)中，在室溫下孵育一個小時。適配體最終的濃度為0.01 mg/ml O孵育完成后，平板用PBST緩沖液沖洗三次，然后與鏈霉親合素耦合辣根過氧化物酶（1:200稀釋在PBS緩沖液中）一起，在室溫下孵育40分鐘。平板再用PBST緩沖液沖洗三次，然后在孔中加入辣根過氧化物酶底物。當藍色出現(xiàn)時，通過IM的H2S04來終止反應，在波長450nm下測試吸光度。所得結果如圖3所示。
【主權項】
1.一種DNA適配體，其特征在于，具有對組氨酸標簽的親和性，包含了 SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2中的任意一個核苷酸序列。2.包含如權利要求1所述的序列之一的寡聚核苷酸用于制備分子的用途，其特征在于，制備的分子對包含組氨酸標簽的分子靶具有親和性，詳細來說: -作為組氨酸標簽的直接抗體激動劑使用， -用于檢測包含組氨酸標簽的分子靶， -用于純化包含組氨酸標簽的分子靶， -用于結合包含組氨酸標簽的分子靶， -用于確定包含組氨酸標簽的分子靶的濃度。
【專利摘要】獲得一種DNA適配體，具有對組氨酸標簽的親和性，且含有SEQ？IDNo.？1和SEQ？ID？No.？2中的任意一個核苷酸序列，并有明確的用途。
【IPC分類】C12N15/115
【公開號】CN105189753
【申請?zhí)枴緾N201480018979
【發(fā)明人】菲利普·巴特尼基, 艾娃·科瓦爾斯卡, 卡塔爾金娜·佩爾斯, 沃依切赫·斯特爾扎卡
【申請人】積克隆斯基大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2014年5月17日
【公告號】EP2997147A1, US20160060631, WO2014185802A1