一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物及其篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種貝類線粒體cox2 [細(xì)胞色素c氧化酶亞基II (cytochrome coxidase subunit II)]基因擴(kuò)增引物的篩選方法，特別是涉及一種北方常見経類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]経類隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，生活于潮間帶至水深400m左右的海域，其肉味鮮美，具有較高的食用價(jià)值。特別是大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶，在我國分布廣泛，是重要的經(jīng)濟(jì)貝類。
[0003]近年來，由于過度采捕、海洋環(huán)境的日益惡化以及棲息地萎縮，蟶類的資源量逐年下降，急需加快對(duì)其多樣性的評(píng)估，為種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用和保護(hù)奠定基礎(chǔ)。線粒體脫氧核糖核酸(Mitochondrial DNA,即mtDNA)因其單親遺傳、無重組、中性進(jìn)化等特性，在群體遺傳多樣性、物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)和方法的不斷進(jìn)步以及測(cè)序成本的減少，在過去十年里，測(cè)定的mtDNA數(shù)量明顯增長。mtDNA的獲得主要采用步移法與鳥槍法，其中步移法成本低，操作簡單，最為常用。步移法使用Long-PCR技術(shù)，Long-PCR引物的設(shè)計(jì)依賴于線粒體基因組短片段序列的獲得。得到的短片段序列越多，越有助于得到基因組全長。目前大竹蟶、長竹蟶、縊蟶的mtDNA已經(jīng)測(cè)定完成，小刀蟶的mtDNA序列還未見報(bào)道。在采用步移法測(cè)定小刀経的mtDNA過程中，利用coxl基因與16S rRNA基因的短片段設(shè)計(jì)的Long-PCR引物有一對(duì)沒有擴(kuò)增成功，阻礙了全長的獲得，必須得到其它的短片段序列。由于cox2基因沒有通用引物，開發(fā)適用性好的cox2基因擴(kuò)增引物可加快線粒體基因組的測(cè)序進(jìn)展，有助于蟶類的多樣性評(píng)估、種質(zhì)資源保護(hù)與利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物的篩選方法，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0005]—種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物的篩選方法，其特征是a、登陸美國國立生物技術(shù)信息中心，下載大竹蟶、長竹蟶、縊蟶線粒體全序列中的cox2序列山、將下載的序列用B1Edit軟件比對(duì)分析，確定序列兩端保守區(qū)域；c、在確定的保守區(qū)域用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)多對(duì)引物，送交送交有合成能力的機(jī)構(gòu)合成；d、將大竹経、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個(gè)體提取DNA，然后分別和合成的多對(duì)引物在反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)引物的擴(kuò)增情況；e、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶單一、擴(kuò)增效率高的一對(duì)引物 cox2CF 和 cox2CR:cox2CF 為 5’ AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3’ ； cox2CR 為 5’GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3，。
[0006]本發(fā)明篩選出一對(duì)用于擴(kuò)增北方常見蟶類線粒體部分cox2序列的引物cox2CF和cox2CR，并確定了其反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增條件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該引物具有條帶單一、擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，有助于快速獲得線粒體基因組全長，滿足蟶類遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究的需要。
【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施本發(fā)明的北方常見蟶類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物的篩選方法時(shí)，分以下五步:
a、登陸美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),下載已有的大竹経、長竹経、溢経線粒體全序列中的cox2序列(Genbank登錄號(hào)為:HQ703012、JN786377 和 JN398366)。
[0008]b、用序列處理軟件 B1Edit (http://www.mb1.ncsu.edu/B1Edit/b1edit.html)對(duì)上述序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，確定出前后端較保守區(qū)域。
[0009]C、經(jīng)比對(duì)后在前后端各100個(gè)堿基對(duì)的較保守區(qū)域內(nèi)，用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier 5 (http://www.premierb1soft.com/primerdesign/index.html)設(shè)計(jì)弓丨物，設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體的出現(xiàn)。設(shè)計(jì)的多對(duì)引物交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
[0010]d、對(duì)采自山東沿海的大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個(gè)體用苯酚-氯仿法提取DNA，加雙蒸水稀釋為100 ng/μ?的工作液備用。
[0011]e、在10 μ I PCR反應(yīng)體系中用合成的多對(duì)引物分別擴(kuò)增這些個(gè)體的cox2片段，該體系包括:100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer (Mg2+plus)，0.2mM dNTPs，引物各 I μ M。PCR擴(kuò)增條件為:94 °C預(yù)變性 3 min，94 °C變性 45s，46-54 °CiI火45s，72 °C延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸5 min。
[0012]本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶單一，擴(kuò)增效率高的一對(duì)引物 cox2CF (5，AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3，)和 cox2CR (5，GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3’):該引物的最佳退火溫度為50°C，產(chǎn)物片段長度約570bp。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種北方常見蟶類線粒體C0X2基因擴(kuò)增引物，其特征是該引物為一對(duì)，引物條帶單一、擴(kuò)增效率高，分別是 cox2CF 和 cox2CR:cox2CF 為 5’ AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3’ ；cox2CR 為 5， GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3，。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物，其特征是引物的最佳退火溫度為50°C，產(chǎn)物片段長度約570bp。3.權(quán)利要求1所述的一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物的篩選方法，包含以下步驟: a、下載序列:登陸美國國立生物技術(shù)信息中心，下載大竹蟶、長竹蟶、縊蟶線粒體全序列中的cox2序列； b、序列比對(duì):將下載的序列用B1Edit軟件比對(duì)分析，確定序列兩端保守區(qū)域； C、引物設(shè)計(jì)與合成:在確定的保守區(qū)域用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)多對(duì)引物，送交有合成能力的機(jī)構(gòu)合成； d、DNA提取:對(duì)采集的大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個(gè)體提取DNA，加雙蒸水稀釋為.100 ng/ μ I的工作液備用； e、引物擴(kuò)增:然后分別和合成的多對(duì)引物在反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)引物的擴(kuò)增情況:在10 μ I PCR反應(yīng)體系中用合成的多對(duì)引物分別擴(kuò)增這些個(gè)體的cox2片段，該反應(yīng)體系包括 100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer (Mg2+ plus),.0.2 mM dNTPs，引物各 I μ M ;PCR 擴(kuò)增條件為:94 °C預(yù)變性 3 min，94 °C變性 45s，46-54°C退火45s，72 °C延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸5 min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴(kuò)增引物及其篩選方法，分為五步：a、登陸美國國立生物技術(shù)信息中心，下載大竹蟶、長竹蟶、縊蟶線粒體全序列中的cox2序列；b、將下載的序列用軟件比對(duì)分析，確定序列兩端保守區(qū)域；c、在確定的保守區(qū)域用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)多對(duì)引物，送交上海生工生物技術(shù)有限公司合成；d、將大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個(gè)體提取DNA，然后分別和合成的多對(duì)引物在反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)引物的擴(kuò)增情況；e、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶單一、擴(kuò)增效率高的一對(duì)引物cox2CF和cox2CR。本發(fā)明篩選出一對(duì)引物具有條帶單一、擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，有助于快速獲得線粒體基因組全長，滿足蟶類遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究的需要。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105200046
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510612109
【發(fā)明人】馮艷微, 劉相全, 韋秀梅, 姜緒, 王衛(wèi)軍
【申請(qǐng)人】山東省海洋資源與環(huán)境研究院
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年9月24日