一種長鏈金屬硫蛋白基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及基因，具體是從四膜蟲Tetr址ymena elliotti中克隆得到的一種長鏈金屬硫蛋白基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金屬對環(huán)境的嚴(yán)重威脅正逐漸成為全球性問題，重金屬在水體中積累到一定的 限度就會對水體-水生植物-水生動物系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，并可能通過食物鏈直接或間接 地影響到人類的自身健康。如何科學(xué)有效地解決重金屬對水體的污染已經(jīng)成為研究的熱 點(diǎn)。目前用于治理水體重金屬污染的化學(xué)法、物理化學(xué)法都將產(chǎn)生污染轉(zhuǎn)移，易造成二次污 染，且對于大流域、低濃度的有害重金屬污染難W處理。
[0003] 而生物法具有效果好、投資少及運(yùn)作費(fèi)用低、易于管理和操作、不產(chǎn)生二次污染等 優(yōu)點(diǎn)，日益受到人們的關(guān)注。近年來，微生物和基因工程技術(shù)逐漸用于水環(huán)境重金屬污染的 治理，并在水體環(huán)境中重金屬污染的治理方面發(fā)揮著越來越重要的作用。如何提高重組工 程菌吸收重金屬離子的能力，是治理水環(huán)境重金屬污染所面臨的重要問題。
[0004]四膜蟲MTs在金屬硫蛋白超家族分類系統(tǒng)中位于第7家族，四膜蟲金屬硫蛋白基 因中沒有內(nèi)含子，因此可W快速地響應(yīng)外界環(huán)境脅迫并加快蛋白表達(dá)。四膜蟲是一種單細(xì) 胞真核模式生物，無細(xì)胞壁，對于外源環(huán)境污染物脅迫敏感，具有快速的細(xì)胞響應(yīng)機(jī)制，因 此被認(rèn)為是毒理學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)研究良好的模式生物之一。
[0005]目前，國內(nèi)外已經(jīng)有將植物，動物金屬硫蛋白轉(zhuǎn)入大腸桿菌中用于治理水環(huán)境重 金屬污染的報(bào)道，重組華溪蟹金屬硫蛋白的工程菌可吸收0. 467X10 4mol/g水體中的CcT; 重組黃瓜類金屬硫蛋白的工程菌可吸收1. 25X10 4mol/g水體中的CcT。但本發(fā)明將四 膜蟲Tetr址ymenaelliotti中克隆得到的一種長鏈金屬硫蛋白基因構(gòu)建的工程菌化21/ SUM0-Te-MTT2-L可吸收4. 38X10 4mol/g水體中的CcT，與之前報(bào)道相比，富集重金屬離子 的能力更強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的金屬硫蛋白基因，并提供一種含有金屬硫蛋白基 因的可吸收重金屬離子的重組工程菌，W及它們在富集水體重金屬中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的一種金屬硫蛋白基因，其核巧酸序列為SEQIDNO: 1。
[0008] 一種金屬硫蛋白突變基因燈e-MTT2-L)，其核巧酸序列為SEQIDN0:2。
[0009] 上述突變基因編碼的多膚，其氨基酸序列為SEQIDNO:3。
[0010] 一種重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L含有所述的突變基因。
[0011] 一種重組工程菌，是將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌得到的重組菌。
[0012] 含金屬硫蛋白基因燈6-MTT2-L)的工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[001引 （1)從四膜蟲Tetr址ymenaelliotti中克隆得到MTT2-L基因，分別在Te-MTT2-L 的5'端和3'端加上BamHI和化0I酶切位點(diǎn)；并通過PCR方法突變基因序列中的一個大 腸桿菌終止密碼子；將突變后的Te-MTT2-L基因連接到表達(dá)載體pSUMO中，獲得重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L；
[0014] (2)將重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L轉(zhuǎn)入大腸桿菌化21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋 白81110-16-1172-以并用Westernblot的方法檢測蛋白的表達(dá)；
[001引檢測實(shí)驗(yàn)：使用不同濃度的CcT處理經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌化21/pSUM0-Te-MTT2-L檢測ODe。。的數(shù)據(jù)，并構(gòu)建劑量構(gòu)效關(guān)系，對照為相同條件下處理的大腸 桿菌化21/pSUMO,每組實(shí)驗(yàn)S個平行。
[0016] 用X射線巧光光譜儀檢測大腸桿菌化21/pSUMO和化21/pSUM0-Te-MTT2-L經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后馨合CcT的能力，每組S個平行。
[0017] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所提供的含有Te-MTT2-L基因的基因工程菌具有馨合水環(huán)境中 金屬離子的能力，反應(yīng)快速，高效，可在處理重金屬（儒、銅、鉛或隸）污水中應(yīng)用。所述的 突變基因及其編碼的多膚也可在重金屬污染修復(fù)中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0018] 圖 1 重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L的鑒定。（Mr為Trans2KDNAMarker;泳道 1為重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L;泳道2為Te-MTT2-L的PCR產(chǎn)物；泳道3為重組質(zhì)粒 pSUM0-Te-MTT2-L的BamHI和化〇I的雙酶切鑒定）
[0019] 圖2重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L的構(gòu)建示意圖。
[0020] 圖 3 目的蛋白SUM0-Te-MTT2-L表達(dá)情況的檢測。（Mr為PremixedProtein Marker;泳道1為化21/SUM0-Te-MTT2-L在0. 05mMIPTG誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)的全菌蛋白；泳道2為 化21/SUM0-Te-MTT2-L未誘導(dǎo)表達(dá)的全菌蛋白；泳道3為化21/SUM0-Te-MTT2-L在0. 05mM IPTG誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)的可溶蛋白）
[0021] 圖4Westernblot檢測目的蛋白SUM0-Te-MTT2-L的表達(dá)。（泳道1為化21/SUM0 全菌，泳道2為化21/SUM0上清；泳道3為化21/SUM0-Te-MTT2-L的全菌；泳道4為化21/ SUMO-Te-MTTS-L的上清）
[0022] 圖 5C(T處理大腸桿菌化21/pE-SUMO和化21/SUM0-Te-MTT2-L后，0D6。。一C(T濃 度關(guān)系圖。
[0023] 圖6大腸桿菌BL21/pSUM0和大腸桿菌地L21/SUM0-Te-MTT2-L馨合C(T情況的檢 測。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1金屬硫蛋白Te-MTT2-L基因的擴(kuò)增、突變和重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L 的構(gòu)建及鑒定
[00幼設(shè)計(jì)引物，
[0026] (1)克隆基因Te-MTT2-L設(shè)計(jì)的引物：
[0027]Te-MTT2-L-F：GGATCCATGGATACTCAAACTCAAAC
[0028]Te-MTT2-L-R：CTCGAGTCAGCATTTGCATTCAGAGC
[0029] (2)基因Te-MTT2-L突變終止密碼子設(shè)計(jì)的引物：
[0030] 突變終止密碼子的引物
[0031]l'ubian-Te-MTT2A-F:GCTGCCAATGCAACCCTTGCAC
[0032]l'ubian-Te-MTT2A-R:GTGCAAGGGTTGCATTGGCAGC
[0033] 上述引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0034]利用Te-MTT2A-F/Te-MTT2A-R，通過PCR技術(shù)從四膜蟲Tetr址ymena elliotti中擴(kuò)增獲得新基因，核巧酸序列為沈QIDN0:1。利用化bian-Te-MTT2-L-F/ 化bian-Te-MTT2A-R，通過PCR方法突變基因序列中的大腸桿菌終止密碼子燈AA)獲得突 變基因Te-MTT2-L核巧酸序列為SEQIDN0:2?；厥誔CR產(chǎn)物并將其與中間載體PMD-18T 按照合適比例混合，16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a大量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒 pMD-18T-Te-MTT2-L并進(jìn)行PCR和酶切鑒定。
[0035] 分別對pMD-18T-Te-MTT2-L和表達(dá)載體pSUMO進(jìn)行BamHI酶切和化〇I酶切， 酶切產(chǎn)物回收，用酶切后的Te-MTT2-L和載體pSUMO,按比例混合，用T4連接酶16°C過夜 連接，連接產(chǎn)物pSUM0-Te-MTT2-L轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a，涂含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平 板，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，純化質(zhì)粒做PCR和BamHI和 化〇I酶切鑒定（圖 1)，Mr為Trans2KPlusIIDNAMarker,Te-MTT2-L的全長為 44化P， pSUM0-Te-MTT2-L酶切后的片段分別為5628bp和44化P。重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L的示 意圖（圖2)。
[0036] 實(shí)施例2金屬硫蛋白基因Te-MTT2-L的表達(dá)和鑒定
[0037]將重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用IPTG誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)地，100化pm，4°C離屯、5min收集細(xì)胞，將細(xì)胞 重懸于PBS緩沖液中，超聲波細(xì)胞破碎儀超聲破碎菌體，收集全菌液及上清液，將表達(dá)產(chǎn)物 進(jìn)行12%SDS-PA(iE分析，未用IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌細(xì)胞株表達(dá)的蛋白做對照。表達(dá)出目 的蛋白SUM0-Te-MTT2-L預(yù)測其大小為36. 4邸，結(jié)果可初步確定SUM0-Te-MTT2-L表達(dá)成功 (圖 3)。
[0038]重組蛋白SUM0-Te-MTT2-L的Westernblotting檢巧U。將BL21/pSUM0 和 BL21/pSUM0-Te-MTT2-L的全菌和上清分別進(jìn)行12 %SDS-PAGE;轉(zhuǎn)膜；封閉；加一抗 Anti-His(l:5000)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)；二抗IgG(l: 15000)解育；LI-C0RDdyss巧紅外 巧光掃描成像。Westernblotting結(jié)果顯示，BL21/pSUM0-Te-MTT2-L全菌和上清蛋白在 30邸處出現(xiàn)條帶，對照化21/pSUMO全菌和上清蛋白在20邸處出現(xiàn)條帶，表明重組蛋白 SUM0-Te-MTT2-L在大腸桿菌中表達(dá)成功（圖4)。
[0039] 實(shí)施例3大腸桿菌BL21/pSUM0和BL21/pSUM0-Te-MTT2-L對C(T的耐受性分析
[0040] 分別將大腸桿菌化21/pE-SUMO和化21/pSUM0-Te-MTT2-L轉(zhuǎn)至含有100yg/mL卡 那霉素的LB培養(yǎng)基巧血）中培養(yǎng)至0D600 = 0. 7時(shí)，加入IPTG至終濃度為0. 05mM，繼續(xù)培 養(yǎng)地，分別誘導(dǎo)SUMO標(biāo)簽蛋白和SUM0-Te-MTT2-L蛋白的表達(dá)。分別將兩種細(xì)胞株轉(zhuǎn)至多 管LB培養(yǎng)基巧mL)中，使其終濃度均為0D600 = 0. 1，同時(shí)向接種有運(yùn)兩種菌株的多管培養(yǎng) 基中分別加入濃度梯度的CcT，繼續(xù)培養(yǎng)化，檢測每管培養(yǎng)基中菌的濃度。
[0041] 數(shù)據(jù)處理：檢測樣品每組設(shè)置S個平行取平均值，繪制菌濃度一檢測樣品CcT濃 度關(guān)系圖（圖5)。
[0042] 實(shí)施例4大腸桿菌化21/pSUM0-Te-MTT2-L富集水體重金屬
[0043] 分別將大腸桿菌化21/pSUMO和化21/pSUM0-Te-MTT2-L轉(zhuǎn)至含有100yg/mL卡那 霉素的LB培養(yǎng)基（100血）中，37°C，180轉(zhuǎn)，培養(yǎng)至0D600 = 0. 7時(shí)，加入IPTG至終濃度為0. 05mM，繼續(xù)培養(yǎng)也分別誘導(dǎo)SUMO標(biāo)簽蛋白和SUM0-Te-MTT2-L蛋白的表達(dá)。向接種有運(yùn) 兩種菌株的培養(yǎng)基中都加入80ug/ml的CcT，繼續(xù)培養(yǎng)化后無菌條件下取出50mL培養(yǎng)中的 培養(yǎng)液，13000巧m離屯、，取上清備用；剩下的50mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至17h，相同條件取上清 樣備用，用X射線巧光光譜儀檢測大腸桿菌化21/pSUMO和化21/pSUM0-Te-MTT2-L經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后馨合CcT的能力。
[0044] 數(shù)據(jù)處理：受試樣品S次平行，菌體馨合CcT能力一受試樣品反應(yīng)時(shí)間關(guān)系圖（圖 6) 〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種長鏈金屬硫蛋白基因，其核苷酸序列為SEQIDNO: 1。2. -種長鏈金屬硫蛋白突變基因Te-MTT2-L，其核苷酸序列為SEQIDN0:2。3. 如權(quán)利要求2所述的突變基因編碼的多肽，其氨基酸序列為SEQIDNO:3。4. 一種重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L，含有權(quán)利要求2所述的突變基因。5. -種重組工程菌，是將權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2-L轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌BL21得到的重組工程菌BL21/pSUM0-Te-MTT2-L。6. 如權(quán)利要求5所述的重組工程菌在處理重金屬污水中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述重金屬為鎘、銅、鉛或汞。8. 如權(quán)利要求2所述突變基因Te-MTT2-L在重金屬污染修復(fù)中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求3所述的多肽在重金屬污染修復(fù)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種長鏈金屬硫蛋白基因及其應(yīng)用。通過PCR技術(shù)從四膜蟲Tetrahymena？elliotti中擴(kuò)增獲得一種新的長鏈金屬硫蛋白基因，突變密碼子后獲得突變基因Te-MTT2-L，連接到載體pSUMO中，獲得含有該基因的重組質(zhì)粒pSUMO-Te-MTT2-L。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌BL21/pSUMO-Te-MTT2-L表達(dá)出可溶性蛋白SUMO-Te-MTT2-L。大腸桿菌BL21/pSUMO-Te-MTT2-L具有很強(qiáng)的重金屬脅迫耐受力和富集重金屬離子的能力，重組基因工程菌BL21/pSUMO-Te-MTT2-L在治理水環(huán)境重金屬污染方面有廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C02F101/20, C12N15/70, C07K14/825, C12N1/21, C02F3/34, C12N15/30
【公開號】CN105200066
【申請?zhí)枴緾N201510762722
【發(fā)明人】許靜, 郭榮, 王偉, 梁愛華
【申請人】山西大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年11月10日