抑制ebf1/ebf2基因表達(dá)的rna元件、檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元 件、檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物激素乙締信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中兩個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1在蛋白水平上受到由 兩個(gè)F-Box類蛋白邸F1/邸F2所介導(dǎo)的泛素化降解調(diào)控。中國專利化2011 1 0110101.0 公開了有乙締時(shí)邸F1/2mRNA的3'UTR能夠抑制其自身mRNA的翻譯，從而使邸F1/2蛋白 合成減少。
[0003]EBF1,邸F2基因成熟mRNA的3，UTR分別為643nt和590nt，在運(yùn)么長的3，UTR中， 是什么元件介導(dǎo)mRNA翻譯抑制尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元件、檢測方法及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：一種抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元 件，包括一串連續(xù)的尿喀晚巧PU)。
[0006] 優(yōu)選地，所述尿喀晚在RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)上。
[0007] 優(yōu)選地，所述尿喀晚序列長度為6-lOnt，包括核屯、序列和在核屯、系列兩側(cè)或一側(cè) 的其他類型堿基。
[0008] 優(yōu)選地，其中核屯、序列為長度5-8nt的連續(xù)尿喀晚。
[0009] 一種抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元件的檢測方法，包括如下步驟：
[0010] (1)構(gòu)建重組載體，邸F1和邸F2的3'UTR按長度分段，分別插入祀GAD載體中GFP 的編碼區(qū)之后；
[0011] (2)兩組重組載體分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥Co^0中，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系； 陽01引 做對步驟似所得轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行乙締處理；
[0013] (4)檢測巧光強(qiáng)度。
[0014] 抑制邸F1/EBF2基因表達(dá)的RNA元件在3'UTR過表達(dá)植株表現(xiàn)出乙締不敏感表型 中的應(yīng)用。
[0015] 抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元件在增強(qiáng)內(nèi)源邸F1/EBF2mRNA翻譯過程中的 應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明首次公開了抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元件為EPU序列，并構(gòu)建重組 載體，轉(zhuǎn)入野生型植株中，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)而檢測其功能元件，EBF1/邸F2基 因中EPU序列的過表達(dá)或缺失介導(dǎo)著mRNA的翻譯抑制或表達(dá)，在植物中過表達(dá)EPU后可產(chǎn) 生于過表達(dá)邸F1/邸F2基因編碼序列相同的生物學(xué)效應(yīng)，為進(jìn)一步研究調(diào)控植物生長發(fā)育 奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0017]圖1為祀GAD載體； 陽01引圖2為具有翻譯抑制功能的片段共有的序列EPU的示意圖；
[0019] 圖3為邸F1 3'UTR的7個(gè)EPU序列位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)上的示意圖；
[0020] 圖4為去掉7個(gè)EPU之后的邸F1 3'UTR二級結(jié)構(gòu)的示意圖； 陽02U 圖5為EPU介導(dǎo)3'UTR的翻譯抑制作用的檢測結(jié)果； 陽02引圖6為邸F2 3'UTR的5個(gè)EPU介導(dǎo)邸F2mRNA的翻譯抑制作用的檢測結(jié)果； 陽02引 圖7為EPU缺失后的邸F1/2mRNA的翻譯不受抑制的檢測結(jié)果；
[0024]圖8為EPU對3'UTR過表達(dá)植株產(chǎn)生乙締不敏感表型的檢測結(jié)果； 陽02引 圖9為過表達(dá)EPU增強(qiáng)內(nèi)源邸F1/2mRNA的翻譯的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[00%] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述。 陽〇27] 實(shí)施例1
[0028] 本實(shí)施例提供一種抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元件。通過將邸F1和邸F2 的3'UTR按長度分別分為5段，插入到圖1所示的祀GAD載體中GFP的編碼區(qū)的終止密 碼子后面，將不同的重組載體分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥Col-0中，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株 系，繼而進(jìn)行乙締處理，處理后分別觀察GFP巧光強(qiáng)度；兩組中均有片段可W使GFP巧光 變?nèi)?，由此說明邸F1和邸F2的3'UTR均表現(xiàn)出對mRNA的翻譯抑制作用。進(jìn)而對運(yùn)兩組 片段中具有翻譯抑制功能的片段進(jìn)行序列分析，用MEME網(wǎng)站http://meme-suite.org/ tools/meme進(jìn)行多序列比對，預(yù)測運(yùn)些序列中共有的元件，發(fā)現(xiàn)運(yùn)些有翻譯抑制功能的核 屯、序列為長度5-8nt的連續(xù)尿喀晚，進(jìn)一步確定核屯、序列長度為7-8nt的連續(xù)尿喀晚，并確 定序列為在此核屯、序列兩側(cè)或一側(cè)添加其他類型堿基至長度為6-lOnt。將運(yùn)些有翻譯抑 制功能的連續(xù)尿喀晚扣）片段，命名為ElthyleneResponsiveRNAelementscontaining 化Iy-U;rid5dates巧PU)，其序列如圖2所示。如圖3所示，用RNAfold網(wǎng)站(http://rna. 憂i.univie.ac.at/cRi-bin/RNAfold.cRi)對EPU進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示運(yùn)些尿喀 晚都在RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)上，在邸F1mRNA3'UTR中，共有7個(gè)位于環(huán)上的EPU。如圖4所 示，當(dāng)將邸F1mRNA3'UTR中的7個(gè)EPU都去掉之后，整體二級結(jié)構(gòu)并沒有明顯變化。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 本實(shí)施例提供EPU在介導(dǎo)邸F1 3'UTR的翻譯抑制作用中的應(yīng)用，將去掉7個(gè)EPU 之后的邸F1 3'UTR(圖4所示）插入祀GAD載體（圖1所示）中，轉(zhuǎn)入野生型擬南芥Co^0 中。如圖5A所示，檢測生長在含有10μΜ乙締合成前體ACC的MS板上的各株系中GFP巧 光強(qiáng)度，去掉EPU的轉(zhuǎn)基因株系中GFP巧光強(qiáng)度與過表達(dá)GFP的巧光強(qiáng)度幾乎相同，顯著強(qiáng) 于中國專利化201110110101.0中公開的G1U(35S::GFP-EBF1U/Col-〇)過表達(dá)的植株中 GFP巧光強(qiáng)度。由此說明，EPU是3'UTR介導(dǎo)翻譯抑制所必需。如圖5B所示，進(jìn)一步設(shè)計(jì) 包含EPU的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，兩端用完全配對的堿基序列保證EPU位于環(huán)上，每個(gè)環(huán)上有兩串EPU， 做成3個(gè)重復(fù)形式即6xEPU，進(jìn)而過表達(dá)在野生型擬南芥Col-0中。如圖5C所示，檢測各 株系中GFP巧光強(qiáng)度，在10μΜACC板上，過表達(dá)6xEPU的轉(zhuǎn)基因植株中GFP巧光很弱，與 G1U(35S: :GFP-EBF1U/Col-〇)過表達(dá)的植株中GFP巧光強(qiáng)度差不多，由此說明EPU是介導(dǎo) 邸FI3'UTR翻譯抑制的充分必要條件。 陽0川 實(shí)施例3 陽03引本實(shí)施例提供EPU在介導(dǎo)邸F2 3'UTR的翻譯抑制作用中的應(yīng)用。如圖6A所示， 與邸F1 3'UTR類似，在邸F2 3'UTR中，鑒定到了 5個(gè)EPU。如圖她所示，將5個(gè)EPU都 去掉后并不影響邸F2mRNA3'UTR整體二級結(jié)構(gòu)；如圖6C所示，去掉5個(gè)EPU之后，轉(zhuǎn)基 因植株中的GFP巧光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。由此說明，去掉EPU后邸F2mRNA的翻譯不受抑制，即 EPU是介導(dǎo)邸F2 3'UTR翻譯抑制的充分必要條件。
[0033] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，邸F1和邸F2的mRNA3'UTR上的EPU作為一個(gè)順式作用元 件能抑制由mRNA到蛋白的翻譯過程。
[0034] 實(shí)施例4
[0035] 本實(shí)施例提供抑制邸F1/EBF2基因表達(dá)的RNA元件在3'UTR過表達(dá)植株表現(xiàn)出乙 締不敏感表型中的應(yīng)用。經(jīng)典的乙締反應(yīng)就是人們所熟知的Ξ重反應(yīng)，具體表現(xiàn)為當(dāng)對植 株施加乙締時(shí)黃化苗呈現(xiàn)出下胚軸變短、變粗，根變短，頂端彎鉤加劇。本實(shí)施例構(gòu)建了內(nèi) 源啟動(dòng)子啟動(dòng)的帶GFP標(biāo)簽的編碼區(qū)加全長3'UTR(P邸F1: :G1巧重組載體和編碼區(qū)去掉7 個(gè)EPU的3'UTR(祀BF1: :G1FΔ7U)重組載體，分別轉(zhuǎn)入擬南芥ebn突變體中。觀察在含 有ΙΟμΜACC(-種乙締生物合成的前體）的培養(yǎng)基上生長3天的黃化苗的表型，如圖7A所 示，pEFl: :GlF/ebfl恢復(fù)了ebn突變體的乙締超敏感表型，而祀BF1: :GlFA7U/ebn則幾 乎完全乙締不敏感。本實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因植株由內(nèi)源啟動(dòng)子啟動(dòng)且轉(zhuǎn)入ebn突變體中，相當(dāng) 于將內(nèi)源邸F1基因3'UTR上的7個(gè)EPU去掉，此時(shí)沒有EPU的3'UTR不再抑制邸F1mRNA 的翻譯過程，邸F1蛋白合成增多，降解EIN3蛋白，導(dǎo)致乙締不敏感表型。同時(shí)，檢測運(yùn)些轉(zhuǎn) 基因植物中邸F1基因的表達(dá)，如圖7B所示，可W看出運(yùn)些轉(zhuǎn)基因植物中邸F1的表達(dá)量與 野生型擬南芥Col-0基本一致。如圖7C所示，通過westernblot實(shí)驗(yàn)對內(nèi)源EIN3抗體檢 巧リ，結(jié)果表明即使加了ACC，祀BFl::GlFΔ7Ul/ebn中也幾乎檢測不到內(nèi)源EIN3蛋白，運(yùn) 與其乙締不敏感表型一致。由此可知，EBF1 3'UTR上的EPU缺失則邸F1mRNA的翻譯不再 受抑制，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出乙締不敏感表型；帶有EPU則邸F1mRNA的翻譯受抑制，轉(zhuǎn)基因 植株表現(xiàn)出正常的乙締反應(yīng)。
[0036] 如圖8A和8B所示，當(dāng)邸F1 3'UTR中的7個(gè)EPU去掉，EBF2 3'UTR的5個(gè)EPU都 去掉之后，過表達(dá)植株則不再有乙締不敏感表型；如圖8C所示，過表達(dá)重復(fù)形式的EPU，則 有與全長3'UTR過表達(dá)相似的乙締不敏感表型。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，EPU是3'UTR過表達(dá) 植株表現(xiàn)出乙締不敏感表型的充分必要條件。
[0037] 實(shí)施例5
[0038] 本實(shí)施例提供抑制邸F1/邸F2基因表達(dá)的RNA元件在增強(qiáng)內(nèi)源邸Fl/EBF2mRNA翻 譯過程中的應(yīng)用。如圖9A和9B所示，polysomeprofiling實(shí)驗(yàn)中，在6xEPU過表達(dá)的植株 中，與polysome結(jié)合的邸F1/2mRNA(即處于翻譯狀態(tài)的邸F1/2mRNA)顯著增加，即過表達(dá) EPU增強(qiáng)了內(nèi)源邸F1/2mRNA的翻譯。而EIN3及看家基因β-ATP的翻譯則不受過表達(dá)的 6xEPU影響，說明過表達(dá)的EPU特異調(diào)控邸F1/2mRNA的翻譯過程。本實(shí)施例中polysome profili實(shí)驗(yàn)操作使用ARTseq?化bosomeProfilingKit并依據(jù)其說明書進(jìn)行，只是不進(jìn) 行酶切建庫而直接進(jìn)入超速離屯、和吸光度測定；之后的RNA提取使用QIAGENRNeasyPlant MiniKit,反牽專錄使用PrimeScript嚴(yán)StandcDNASynthesisKit。
[0039]W上實(shí)施例的先后順序僅為便于描述，不代表實(shí)施例的優(yōu)劣。
[0040] 最后應(yīng)說明的是：W上實(shí)施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡 管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然 可W對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替 換；而運(yùn)些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精 神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抑制EBF1/EBF2基因表達(dá)的RNA元件，其特征在于，包括一串連續(xù)的尿嘧啶 (EPU) 〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA元件，其特征在于，所述尿嘧啶在RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)上。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的RNA元件，其特征在于，所述尿啼啶序列長度為6-10nt， 包括核心序列和在核心系列兩側(cè)或一側(cè)的其他類型堿基。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNA元件，其特征在于，其中核心序列為長度5-8nt的連續(xù)尿 嘧啶。5. -種抑制EBF1/EBF2基因表達(dá)的RNA元件的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： ⑴構(gòu)建重組載體，EBF1和EBF2的3'UTR按長度分段，分別插入pEGAD載體中GFP的 編碼區(qū)之后； (2) 兩組重組載體分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥Col-Ο中，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系； (3) 對步驟（2)所得轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行乙烯處理； (4) 檢測熒光強(qiáng)度。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述抑制EBF1/EBF2基因表達(dá)的RNA元件在3'UTR過表達(dá)植株表 現(xiàn)出乙烯不敏感表型中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述抑制EBF1/EBF2基因表達(dá)的RNA元件在增強(qiáng)內(nèi)源EBF1/ EBF2mRNA翻譯過程中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制EBF1/EBF2基因表達(dá)的RNA元件，包括一串連續(xù)的尿嘧啶(EPU)，并構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)入野生型植株中，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)而檢測其功能元件，EBF1/EBF2基因中EPU序列的過表達(dá)或缺失介導(dǎo)著mRNA的翻譯抑制或表達(dá)，在植物中過表達(dá)EPU后可產(chǎn)生于過表達(dá)EBF1/EBF2基因編碼序列相同的生物學(xué)效應(yīng)，為進(jìn)一步研究調(diào)控植物生長發(fā)育奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/113, G01N27/64, C12N15/82
【公開號】CN105255891
【申請?zhí)枴緾N201510683938
【發(fā)明人】郭紅衛(wèi), 馬夢迪
【申請人】北京大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月20日