Dna的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種DNA的檢驗(yàn)方法，具體地說是一種在案件中微量及常量生物檢材的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著DNA檢驗(yàn)的廣泛運(yùn)用，大批量的生物檢材(微量檢材和常用量檢材)擺在面前，如何高效檢驗(yàn)成為一個(gè)急需解決的問題；傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法如CHELEX —100法、硅珠法、磁珠法等一般只能針對某一類檢材，檢驗(yàn)中只能采用分類檢驗(yàn)和單管檢驗(yàn)的方法，方法適應(yīng)性差，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，檢驗(yàn)速度低，特別是對接觸性汗斑類微量生物檢材的檢驗(yàn)靈敏度差，檢出率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種不但適應(yīng)范圍廣、檢驗(yàn)速度快而且檢驗(yàn)靈敏度高、檢出率高的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法，包括以下步驟:
步驟A:將包含2-3納克DNA含量的檢材放入孔板中，采用硅珠法提取DNA，DNA提取過程中，孔板的每孔中加入裂解液160-180微升，1摩爾濃度的DTT10-20微升，使DNA釋放到液體中后，去除載體，保留液體；
步驟B:另取一塊PCR擴(kuò)增板，PCR擴(kuò)增板的每孔中加入5-6微升硅珠液體，將上一步驟獲得的液體移到PCR擴(kuò)增板中，并使硅珠懸浮；
步驟C:將PCR擴(kuò)增板蓋上膠蓋，放置于4攝氏度的溫度環(huán)境中30分鐘以上；取出PCR擴(kuò)增板用平板離心機(jī)進(jìn)行離心處理，使硅珠附著在PCR擴(kuò)增板的板孔內(nèi)；取出后將PCR擴(kuò)增板翻轉(zhuǎn)過來，輕甩兩次以上，將液體甩棄，硅珠保留在管底；
步驟D:使用體積濃度70%的冷乙醇清洗硅珠，去除雜質(zhì)，再干燥硅珠；
步驟E:采用常規(guī)擴(kuò)增液和擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增，每孔中加入擴(kuò)增混合液，同時(shí)用移液器吹打使娃珠懸浮；
步驟F:將PCR擴(kuò)增板蓋上膠蓋，按常規(guī)方法做PCR擴(kuò)增；
步驟G:擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增板的每孔中加入純水，放入平板離心機(jī)中瞬時(shí)離心，每孔取適量產(chǎn)物上機(jī)檢測。
[0005]所述步驟A中，將低于3納克的微量生物檢材直接全部放入到孔板中。
[0006]所述步驟B中，移液時(shí)PCR擴(kuò)增板的每孔吹找4-5次。
[0007]所述步驟C中，用平板離心機(jī)進(jìn)行離心處理過程中，用平板離心機(jī)3000轉(zhuǎn)離心3分鐘。
[0008]所述步驟D中，用乙醇清洗硅珠過程中，每孔用70%負(fù)20攝氏度的乙醇200微升洗硅珠2次。
[0009]采用上述方法后，與傳統(tǒng)方法對案件現(xiàn)場檢材的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn):血、唾液斑等常量檢材二者的檢出率均在95%以上，與傳統(tǒng)方法無顯著差別；對于現(xiàn)場遺留的作案工具、物品等檢材，檢出率由來50%提高到70%左右；赤手足汗斑印跡和手套印跡等微量檢材，檢出率由來12%提高到26%左右，效果成為突出；因此不但對各類檢材的適應(yīng)性好，檢驗(yàn)省時(shí)省力，而且將案件現(xiàn)場微量生物檢材的檢出率提高2倍以上，有很高的實(shí)際運(yùn)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0011]本發(fā)明的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法，包括以下步驟:
步驟A:將適量檢材放入孔板中，如是血、唾液斑等常量檢材則剪取2-3納克左右DNA含量的檢材(直徑為0.12厘米圓形濾紙血斑DNA含量約1個(gè)納克)，如為接觸性汗斑等低于3納的微量生物檢材則可取全部；采用硅珠法提取DNA，DNA提取過程中，孔板的每孔中加入裂解液160-180微升，1摩爾濃度的DTT10-20微升，使DNA釋放到液體中后，去除載體，保留液體；
步驟B:另取一塊PCR擴(kuò)增板，PCR擴(kuò)增板的每孔中加入4-5微升硅珠液體，將上一步驟獲得的液體移到PCR擴(kuò)增板中，移液時(shí)PCR擴(kuò)增板的每孔吹找4-5次，使硅珠懸??；
步驟C:將PCR擴(kuò)增板蓋上膠蓋，放置于4攝氏度的冰箱中30分鐘以上；從冰箱中取出PCR擴(kuò)增板用平板離心機(jī)進(jìn)行離心處理，使硅珠附著在PCR擴(kuò)增板的板孔內(nèi)；取出后將PCR擴(kuò)增板翻轉(zhuǎn)過來，輕甩兩次以上，將液體甩棄，硅珠保留在管底；
步驟D:用乙醇清洗硅珠，最后一次甩棄乙醇，硅珠在99攝氏度的溫度下用4分鐘烤干;
其中，用乙醇清洗硅珠過程中，每孔用70%負(fù)20攝氏度的乙醇200微升洗硅珠2次。
[0012]步驟E:采用常規(guī)擴(kuò)增液和擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增，例如采用ID-PLUS試劑擴(kuò)增，擴(kuò)增混合液按引物:dNTP:純水1 '2:2配制；每孔中加入10微升擴(kuò)增混合液，每孔中加入擴(kuò)增液時(shí)，用移液器吹打使硅珠懸?。?br> 步驟F:將PCR擴(kuò)增板蓋上膠蓋，按11微升體系常規(guī)做PCR擴(kuò)增；
步驟G:擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增板的每孔中加入10微升純水，放入平板離心機(jī)中瞬時(shí)離心，每孔取2微升產(chǎn)物上機(jī)檢測。
[0013]本發(fā)明中的以上步驟均可以用自動(dòng)化工作平臺(tái)完成。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟A:將包含低于3納克DNA含量的檢材放入孔板中，采用硅珠法提取DNA，DNA提取過程中，孔板的每孔中加入裂解液160-180微升，1摩爾濃度的DTT10-20微升，使DNA釋放到液體中后，去除載體，保留液體； 步驟B:另取一塊PCR擴(kuò)增板，PCR擴(kuò)增板的每孔中加入5-6微升硅珠液體，將上一步驟獲得的液體移到PCR擴(kuò)增板中，并使硅珠懸?。? 步驟C:將PCR擴(kuò)增板蓋上膠蓋，放置于4攝氏度的溫度環(huán)境中30分鐘以上；取出PCR擴(kuò)增板用平板離心機(jī)進(jìn)行離心處理，使硅珠附著在PCR擴(kuò)增板的板孔內(nèi)；取出后將PCR擴(kuò)增板翻轉(zhuǎn)過來，輕甩兩次以上，將液體甩棄，硅珠保留在管底； 步驟D:使用冷乙醇清洗硅珠，去除雜質(zhì)，再干燥硅珠； 步驟E:采用常規(guī)擴(kuò)增液和擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增，每孔中加入擴(kuò)增混合液，同時(shí)用移液器吹打使娃珠懸??； 步驟F:將PCR擴(kuò)增板蓋上膠蓋，按常規(guī)方法做PCR擴(kuò)增； 步驟G:擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增板的每孔中加入純水，放入平板離心機(jī)中瞬時(shí)離心，每孔取適量產(chǎn)物上機(jī)檢測。2.按照權(quán)利要求1所述的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法，其特征在于:所述步驟A中，將低于3納克的微量生物檢材直接全部放入到孔板中。3.按照權(quán)利要求1所述的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法，其特征在于:所述步驟B中，移液時(shí)PCR擴(kuò)增板的每孔吹找4-5次。4.按照權(quán)利要求1所述的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法，其特征在于:所述步驟C中，用平板離心機(jī)進(jìn)行離心處理過程中，用平板離心機(jī)3000轉(zhuǎn)離心3分鐘。5.按照權(quán)利要求1所述的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法，其特征在于:所述步驟D中，用乙醇清洗硅珠過程中，每孔用70%負(fù)20攝氏度的乙醇200微升洗硅珠2次。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在案件中微量及常量生物檢材的DNA的硅珠直擴(kuò)檢驗(yàn)方法。它包括以下步驟：步驟A：采用硅珠法提取DNA，使DNA釋放到液體中后，去除載體，保留液體；步驟B：將上一步驟獲得的液體移到PCR擴(kuò)增板中，使硅珠懸浮；步驟C：使硅珠附著在PCR擴(kuò)增板的板孔內(nèi)；硅珠保留在管底；步驟D：用乙醇清洗硅珠；步驟E：采用ID-PLUS試劑擴(kuò)增；步驟F：按11微升體系常規(guī)做PCR擴(kuò)增；步驟G：擴(kuò)增結(jié)束后，加入純水后取產(chǎn)物上機(jī)檢測。采用上述方法后，不但對各類檢材的適應(yīng)性好，檢驗(yàn)省時(shí)省力，而且將案件現(xiàn)場微量生物檢材的檢出率提高2倍以上，有很高的實(shí)際運(yùn)用價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105256022
【申請?zhí)枴緾N201510668520
【發(fā)明人】毛坤云
【申請人】毛坤云
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月13日