杏鮑菇復(fù)合群est-ssr分子標(biāo)記特異引物體系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及杏鮑茹復(fù)合群EST-SSR分子標(biāo)記特異 引物體系及其在鑒別杏鮑茹復(fù)合群的不同菌株的用途。 技術(shù)背景
[0002] 杏鮑茹（WeyrWwferjT?知i)，又名刺芹側(cè)耳，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如 鮑魚(yú)的口感而得名。是近年來(lái)開(kāi)發(fā)栽培成功的及食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品 種。阿魏茹（Wwro加S/eru知6)又名阿魏側(cè)耳、阿魏磨，屬擔(dān)子菌亞口層菌綱傘菌目側(cè)耳 科側(cè)耳屬，是干旱草原上具有代表性的葦菌。由于其子實(shí)體脆嫩可口，香味濃郁，有草原牛 肝菌的美稱(chēng)；又因其具有消積、殺蟲(chóng)、治療肉積、瘡塊、久追、巧勞等藥效，當(dāng)?shù)厝罕娮u(yù)之為天 山神茹和西天白靈芝。白靈茹（Weyroi化erjT?知i沉/的0. 是白靈側(cè)耳的商 品名稱(chēng)，隸屬于真菌口、擔(dān)子菌亞Π、真菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是近年來(lái)逐漸發(fā)展起 來(lái)的食用菌新秀之一。
[0003] 杏鮑茹、白靈茹、阿魏茹形態(tài)相似，且遺傳關(guān)系尚不明確。有研究人員認(rèn)為，阿魏磨 與白靈茹為刺芹側(cè)耳種下的2個(gè)變種，但也有人認(rèn)為，運(yùn)Ξ者分別為不同的種。白靈茹與阿 魏磨在外觀和口感上均很接近，人們易將兩者混淆。但實(shí)際上它們是親緣關(guān)系非常近的兩 個(gè)種。利用PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序測(cè)定了阿魏茹、白靈茹與杏鮑茹rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（口巧 的序列，測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，阿魏磨、白靈茹和杏鮑茹Ξ者之間親緣關(guān)系較近，其中白靈茹 與杏鮑茹具有非常近的親緣關(guān)系，但阿魏磨、白靈茹和杏鮑茹為3個(gè)不同的種。因此，本發(fā) 明中暫稱(chēng)Ξ個(gè)菌種為杏鮑茹復(fù)合群。
[0004] 食用菌最早是采用形態(tài)學(xué)特征為分類(lèi)依據(jù)，雖然形態(tài)特征能在一定程度上進(jìn)行很 好的類(lèi)群的劃分，但子實(shí)體的形態(tài)特征易受外界環(huán)境條件的影響，因而很不穩(wěn)定。因此，形 態(tài)鑒別不能準(zhǔn)確反映被鑒定物種的分類(lèi)地位。除了形態(tài)學(xué)分類(lèi)外，還有利用括抗試驗(yàn)、同工 酶分析來(lái)進(jìn)行菌株的鑒定，但是他們都各自有一些缺點(diǎn)，受影響的因素很多，還需要輔助其 他試驗(yàn)才能將菌株鑒別清楚。
[0005] 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，遺傳標(biāo)記技術(shù)也得到了迅猛的 發(fā)展。目前，用于作物種質(zhì)資源鑒定的分子標(biāo)記主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但對(duì)于核 屯、種質(zhì)構(gòu)建、基因性狀鑒定、品種指紋圖譜建庫(kù)等研究，SSR分子標(biāo)記是公認(rèn)的最佳方法。開(kāi) 發(fā)SSR標(biāo)記主要有構(gòu)建與篩選基因組文庫(kù)法、微衛(wèi)星富集法、省略篩庫(kù)法和數(shù)據(jù)庫(kù)捜索法 等。其中數(shù)據(jù)庫(kù)捜索法，尤其是從表達(dá)序列標(biāo)簽巧ST)數(shù)據(jù)庫(kù)中捜索，開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記， 已經(jīng)成為一種廣為采用的方法。EST-SSR標(biāo)記相對(duì)于基因組SSR標(biāo)記而言，由于其來(lái)自于轉(zhuǎn) 錄譜，能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，使EST-SSR標(biāo)記可W直接與目標(biāo)性狀（如高產(chǎn)或多抗）相 聯(lián)系，在分子標(biāo)記輔助選擇上具有更高的應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 針對(duì)食用菌的SSR分子標(biāo)記引物系統(tǒng)比較少，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有針對(duì)杏鮑茹復(fù)合 群鑒定的專(zhuān)用EST-SSR分子標(biāo)記特異引物，因此本發(fā)明對(duì)于杏鮑茹、白靈茹、阿魏茹及其復(fù) 合群的資源鑒定和開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供杏鮑茹復(fù)合群EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系 及其應(yīng)用。
[0009] 杏鮑茹復(fù)合群EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它包括：引物1、2、3、4和\或5; 引物 1:AAGAGACCGCAAACGAAATG CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA引物 2:GAAAGCTCGCCATCAGACTC AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC 引物 3:ATCGGATTCGTTGTCGGTAG CGGATTCCTCCTCTTCTTCC 引物 4:ATCTCACGTTGAGCAGGTCC ACCTATCACGAGCCGCATAC 引物日：TCCTCTATCTCGCCCATCAC GGGACAGCCTATTCGAGGAT 杏鮑茹復(fù)合群的不同菌株鑒定方法，它包括： 1) 提取杏鮑茹復(fù)合群菌種的基因組DNA; 2) W基因組DNA為模板，用上述引物體系進(jìn)行擴(kuò)增； 3) sequi-GenGT核酸電泳系統(tǒng)上進(jìn)行聚丙締酷胺電泳分離，照相后統(tǒng)計(jì)條帶，轉(zhuǎn)換成 0-1數(shù)值，利用軟件SPSS10. 0進(jìn)行聚類(lèi)分析。
[0010] 本發(fā)明提供了杏鮑茹復(fù)合群EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它是采用5對(duì)分子 標(biāo)記特異引物，在檢測(cè)過(guò)程中同時(shí)使用，在30個(gè)杏鮑茹復(fù)合群菌種中有多態(tài)性，在30個(gè)杏 鮑茹復(fù)合群中進(jìn)行的遺傳多樣性分析與側(cè)耳屬白靈茹、杏鮑茹和阿魏茹的分類(lèi)常識(shí)相吻合 (圖1)，是穩(wěn)定存在的新標(biāo)記，可W直接將本發(fā)明所提供的5對(duì)引物對(duì)應(yīng)用于更多杏鮑茹復(fù) 合群上，進(jìn)行種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析；5對(duì)分子標(biāo)記特異引物均來(lái)自于杏鮑茹復(fù)合群 發(fā)育相關(guān)基因EST序列，為克隆杏鮑茹復(fù)合群發(fā)育相關(guān)基因、基因序列分析奠定了良好的 基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為基于5對(duì)SSR位點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建的30份杏鮑茹復(fù)合群UPGM聚類(lèi)圖。圖中的 品種或種名后的字母代表杏鮑茹復(fù)合群菌種的類(lèi)型。 【具體實(shí)施方式】[001引一、提取DNA (1)配制DNA提取緩沖液：2%CTAB，0. 1MTris，20mM邸TA，1. 4M化C1，P冊(cè).0 和DNA溶解緩沖液TE:10MmTris;1Mm邸TA;PH=8. 0。
[0013] (2)對(duì)上述30個(gè)杏鮑茹復(fù)合群菌株材料進(jìn)行如下處理： 1)吸取5mlCTAB提取緩沖液置于65 °C水浴鍋中預(yù)熱，加0.1gPVP(去除酪類(lèi)物 質(zhì)）。
[0014] 2)分別稱(chēng)取0. 1g不同的杏鮑茹復(fù)合群菌株的菌絲體放入研鉢中，于液氮中迅速 研磨成粉并轉(zhuǎn)入65 °C預(yù)熱的DNA提取液中，顛倒離屯、管5-10次。（不要?jiǎng)×艺袷?，防?DNA斷裂）并放入65 °C水浴中30min,期間輕輕顛倒搖動(dòng)幾次。
[0015] 3) 4°C,10000巧m離屯、5min,吸取上清液并加其等體積氯仿/異戊醇（24 :1)輕 輕混勻，10000巧m離屯、10min。
[0016] 4)取上清液，用等體積苯酪/氯仿/異戊醇（25:24:1)反復(fù)抽提。
[0017] 5)加入1/10體積NaAc(3mol/L，抑5. 2)和2倍體積冷乙醇，輕輕顛倒離屯、管幾 次后置于-20 °C冰箱中2h來(lái)沉淀DNA。
[0018] 6)取出于 4 °C，10000;rpm離屯、10min。
[0019] 7)用70 %乙醇洗涂沉淀。在超凈工作臺(tái)上將沉淀吹干。
[0020] 8)加100μ1TE緩沖液回溶DNA沉淀，同時(shí)加入2μ1RNase，置37 °C處理1 h。
[0021] 9)轉(zhuǎn)入1.5ml離屯、管中，將總體系擴(kuò)大后加入等體積的苯酪/氯仿/異戊醇 (25:24:1)和氯仿/異戊醇（24:1)分別抽提。
[002引 10)吸取上清，重新沉淀DNA，用70 %乙醇洗，吹干。
[0023] 11)加入100μ1的TE或去離子水回溶。取1-2μ1樣品與1 %的瓊脂糖凝膠 上電泳，檢查樣品DNA的質(zhì)量。
[0024] (3)將杏鮑茹、白靈茹、阿魏茹不同發(fā)育時(shí)期的材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選得 到40對(duì)EST-SSR引物，具體見(jiàn)表2。
[00巧]W步驟（2)提取的待鑒定樣品總DM為模板DM,w篩選后得到40對(duì)特異引物為 檢測(cè)體系引物：EST-SSR標(biāo)記引物1-40,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用20μ1反應(yīng)體系： 在 20μ1 反應(yīng)體系中分另〇加入 10XPCRbuffer(Mg2+)2μl，2mMdNTP0. 2μ1，5UTaq DMpolymerase0. 1μ1，正向引物0. 1μ1，反向引物0. 5μ1，巧光標(biāo)識(shí)引物0. 4μ1，50ng/μ1DM模板2μΚΡΟ?反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；94 °C變性30s，60°C 復(fù)性45s，72°C延伸1min,反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C后延伸lOmin。
[0026] (4)將步驟（3)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與上樣緩沖液（98%的去離子甲酯胺10Mm邸ΤΑ (Ρ冊(cè).0)，0. 025%二甲苯青，0. 025%嗅酪蘭）混合均勻后，取2μ1點(diǎn)樣，在Sequi-GenGT核 酸電泳系統(tǒng)度I〇-Rad，USA)中通過(guò)6%聚丙締酷胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為1XTBE 燈riS-棚酸），在25 °C、2000V恒壓下電泳2h。
[0027] 通過(guò)銀染法顯影，拍照、記錄結(jié)果，銀染法具體步驟如下： 1、 電泳完畢后，膠板用10%醋酸溶液緩慢搖動(dòng)并固定15分鐘，然后用去離子水漂洗3 次； 2、 將漂洗后的膠板用含有0.Iw/v硝酸銀和0. 15%甲醒的溶液染色30分鐘； 3、 染色后，用去離子水漂洗膠板2-3次，然后用含有3%碳酸鋼和0. 15%甲醒的溶液染 色3-5分鐘，緩慢搖動(dòng)，直到條帶清晰；然后放入10%醋酸溶液固定10分鐘，然后用去離子 水漂洗5-10分鐘，驚干，照相記錄。
[0028] 利用40對(duì)EST-SSR引物對(duì)30個(gè)杏鮑茹復(fù)合群品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并利用6% 聚丙締酷胺凝膠電泳后銀染檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)其中的5對(duì)EST-SSR引物（即本發(fā)明所述標(biāo)記SEQ IDNO 其序列特征如表2所示）在30個(gè)不同的杏鮑茹復(fù)合群菌種上表現(xiàn)多態(tài)性，將 30個(gè)菌株利用5對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行聚丙締酷胺電泳后得到的多態(tài)性條帶轉(zhuǎn)換成0-1數(shù) 值(有條帶記為1，無(wú)條帶記為0)，將得到的0-1數(shù)值表錄入excel表中，利用生物統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS10. 0將之前統(tǒng)計(jì)的數(shù)值進(jìn)行0-1型變量聚類(lèi)分析，得到30個(gè)不同的杏鮑茹復(fù)合群菌株 的UPGMA聚類(lèi)圖，聚類(lèi)得到的樹(shù)狀圖表明運(yùn)5對(duì)EST-SSR引物可W將30個(gè)不同的杏鮑茹復(fù) 合群分為杏鮑茹、白靈茹和阿魏茹Ξ大類(lèi)討目應(yīng)的菌株信息及編號(hào)見(jiàn)表1)，運(yùn)種分類(lèi)結(jié)果與 杏鮑茹復(fù)合群的形態(tài)學(xué)分類(lèi)相符合(供試的30個(gè)菌株已經(jīng)進(jìn)行了出茹試驗(yàn)，并通過(guò)形態(tài)學(xué) 進(jìn)行了鑒定，分別為10株杏鮑茹，10株白靈茹，10株阿魏茹)，而且通過(guò)樹(shù)形聚類(lèi)圖也可W 看出，分屬杏鮑茹、白靈茹和阿魏茹的各個(gè)菌株均能夠區(qū)分開(kāi)(相同的菌株會(huì)聚類(lèi)到一起)， 說(shuō)明運(yùn)5對(duì)EST-SSR引物能夠用于杏鮑茹、白靈茹、阿魏茹及其復(fù)合群的種質(zhì)資源鑒定，并 可用于杏鮑茹復(fù)合群種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 杏鮑菇復(fù)合群EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它包括：引物1、2、3、4和\或5; 引物 1:AAGAGACCGCAAACGAAATG; CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA； 引物 2:GAAAGCTCGCCATCAGACTC; AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC； 引物 3:ATCGGATTCGTTGTCGGTAG; CGGATTCCTCCTCTTCTTCC； 引物 4:ATCTCACGTTGAGCAGGTCC; ACCTATCACGAGCCGCATAC； 引物 5:TCCTCTATCTCGCCCATCAC; GGGACAGCCTATTCGAGGAT〇2. 杏鮑菇復(fù)合群的不同菌株鑒定方法，它包括： 1) 提取杏鮑菇復(fù)合群菌種的基因組DNA; 2) 以基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物體系進(jìn)行擴(kuò)增； 3. sequi-GenGT核酸電泳系統(tǒng)上進(jìn)行聚丙稀酰胺電泳分離，照相后統(tǒng)計(jì)條帶，轉(zhuǎn)換成 0-1數(shù)值，利用軟件SPSS10. 0進(jìn)行聚類(lèi)分析。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了杏鮑菇復(fù)合群EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它是采用5對(duì)分子標(biāo)記特異引物，在檢測(cè)過(guò)程中同時(shí)使用，在30個(gè)杏鮑菇復(fù)合群菌種中有多態(tài)性，在30個(gè)杏鮑菇復(fù)合群中進(jìn)行的遺傳多樣性分析與側(cè)耳屬白靈菇、杏鮑菇和阿魏菇的分類(lèi)常識(shí)相吻合，是穩(wěn)定存在的新標(biāo)記，可以直接將本發(fā)明所提供的5對(duì)引物對(duì)應(yīng)用于更多杏鮑菇復(fù)合群上，進(jìn)行種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析，5對(duì)分子標(biāo)記特異引物均來(lái)自于杏鮑菇復(fù)合群發(fā)育相關(guān)基因EST序列，為克隆杏鮑菇復(fù)合群發(fā)育相關(guān)基因、基因序列分析奠定了良好的基礎(chǔ)，并且大大縮短了分析周期，提高研究效率，對(duì)食用菌分子標(biāo)記選擇育種的發(fā)展具有重要意義。
【IPC分類(lèi)】C12R1/645, C12N15/11, C12Q1/04, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105256050
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510763415
【發(fā)明人】宋冰, 付永平, 李玉, 蘇文英, 代月婷, 郭昱秀, 王新新, 段明政, 李丹, 李長(zhǎng)田, 杜鵑, 楊洋, 劉源
【申請(qǐng)人】吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月11日