一種酶制劑，制備方法及其在降解蘇丹紅上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶制劑及其制備方法，并將其酶制劑應(yīng)用于降解蘇丹紅上，屬于 生物工程和環(huán)境污染物處理領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇丹紅是一種親脂性偶氮類化學(xué)染色劑（非食品添加劑），主要用于油彩、機(jī)油、 蠟和鞋油等產(chǎn)品的染色，在食品中非天然存在，主要包括I、II、III和IV四種類型。該類物 質(zhì)具有致突變性和致癌性，對人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用，在我國禁止使用于食 品中。因此，環(huán)境中的蘇丹紅的存在直接影響人類身體健康。目前報道蘇丹紅的研究主要 集中在食品中蘇丹紅含量的分析與檢測方面，而對環(huán)境中蘇丹紅的降解方法研究較少，相 關(guān)報道為Ti02光催化降解和一種銳頂鐮孢菌的微生物降解。因此，研究環(huán)境中蘇丹紅的降 解具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種降解蘇丹紅I，II，III，IV的微生物酶制劑及其制備 方法，該方法具有工藝簡單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，制備的酶制劑催化活性高、酶 活穩(wěn)定，存儲運(yùn)輸方便。
[0005] 本發(fā)明的一種降解蘇丹紅I，II，III，IV的酶制劑的制備方法，包括：
[0006] (1)將微生物菌種置于斜面培養(yǎng)基活化后置于無菌操作環(huán)境下，用接種針劃取 0. 5cmX0. 5cm的菌塊接種于預(yù)先設(shè)有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，置于轉(zhuǎn)速為120r/min的恒溫 振蕩器中，在28°C下恒溫培養(yǎng)4天，得到種子液；
[0007] (2)將種子液轉(zhuǎn)入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在轉(zhuǎn)速為120r/min的丨旦溫振蕩器 中，28°C下恒溫培養(yǎng)7天；將培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心lOmin收集菌絲體；
[0008] (3)用50mM磷酸緩沖液清洗菌絲體后再在液氮下研磨至均一粉末，收集菌絲體粉 末，加入50mM磷酸緩沖液，置于lOOOOrpm冷凍離心機(jī)中4°C離心lOmin后取上清液即為粗 酶液；然后在上清液中加入硫酸銨至終濃度為40%wt，在4°C下放置24h后置于lOOOOrpm 冷凍離心機(jī)中4°C離心lOmin，所得沉淀即為酶制劑。
[0009] 所述步驟（1)中的微生物為單色云芝（Coriolusunicolor)。
[0010] 所述步驟（1)中的斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA)，即將200g/L的去皮土 豆?jié){液與20g/L的葡萄糖和20g/L瓊脂經(jīng)熱溶混勻制得，pH自然。
[0011] 所述步驟⑴中的種子培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB)，即將200g/L的去皮土 豆?jié){液與20g/L的葡萄糖經(jīng)混合后制得，pH自然。
[0012] 所述步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯基礎(chǔ)培養(yǎng)基（SPM)，即將200g/L的去皮土 豆?jié){液與20g/L的葡萄糖，3g/LΚΗ2Ρ04,1. 5g/LMgS04 · 7H20和微量維生素B1經(jīng)混合后制 得，pH6. 0。
[0013] 所述步驟（3)中的菌絲體與磷酸緩沖液的添加比例為，菌絲體濕重/溶液體積= 1/1. 5〇
[0014] 所述步驟（3)中酶制劑分子量范圍經(jīng)SDS-PAGE分析為50-85KD，該酶制劑中還包 括分子量為55KD的多酚氧化酶。
[0015] 本發(fā)明將上述的微生物單色云芝（Coriolusunicolor)應(yīng)用于降解蘇丹紅I、蘇 丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV中的一種或多種上。
[0016] 更進(jìn)一步，本發(fā)明將上述的酶制劑應(yīng)用于降解蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、 蘇丹紅IV中的一種或多種上。對蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV的降解率為 83% -91 %，可應(yīng)用于環(huán)境染料污染物治理領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III和蘇丹紅IV標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。
[0018] 圖2 :硫酸銨分級沉淀部位SDS-PAGE圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下述試驗(yàn)和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。一種酶制劑，制備方法及其 在降解蘇丹紅上的應(yīng)用，實(shí)施過程如下：
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 本發(fā)明的酶制劑，可以從微生物單色云芝（Coriolusunicolor)發(fā)酵后的菌絲體 中獲得。具體步驟如下：
[0022] 1.種子培養(yǎng)
[0023] (1)配置種子培養(yǎng)基：將200g去皮土豆切成小塊，加適量水煮沸30min，用紗布過 濾，濾液中加入葡萄糖20g，自來水定容1L，平均分裝于10個250mL的錐形瓶中（約lOOmL/1 個錐形瓶），在121°C下滅菌20min。
[0024] (2)種子培養(yǎng)：將單色云芝（Coriolusunicolor)菌種置于斜面培養(yǎng)基活化后置 于無菌操作環(huán)境下，用接種針劃取0. 5cmX0. 5cm的菌塊接種于預(yù)先設(shè)有種子培養(yǎng)基的搖 瓶中，置于轉(zhuǎn)速為120r/min的恒溫振蕩器中，在28°C下恒溫培養(yǎng)4天，得到種子液。
[0025] 2.發(fā)酵培養(yǎng)
[0026] (1)配置發(fā)酵培養(yǎng)基：將800g去皮土豆切成小塊，加適量水煮沸30min，用紗布過 濾，濾液中加入葡萄糖80g，自來水定容4L，平均分裝于20個500mL的錐形瓶中（約200mL/l 個錐形瓶），在121°C下滅菌20min。
[0027] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液在無菌操作環(huán)境下接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為 120r/min的恒溫振蕩器上，在28°C下恒溫培養(yǎng)7天。
[0028] 3.酶制劑制備
[0029] (1)通過離心收集菌絲體200g(濕重），用50mM磷酸緩沖液清洗菌絲體后再在液 氮下研磨至均一粉末，收集菌絲體粉末，加入50mM磷酸緩沖液300mL，置于lOOOOrpm冷凍離 心機(jī)中4°C離心lOmin后取上清液即為粗酶液。
[0030] (2)往上清液中加入硫酸銨至終濃度為40 %wt，在4°C下放置24h后置于 lOOOOrpm冷凍離心機(jī)中4°C離心10min，所得沉淀即為酶制劑。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 本發(fā)明的酶制劑，用于降解蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV中的一種或 多種上。具體步驟如下：
[0033] (1)取上述酶制劑600mg，溶于50mL50mM磷酸緩沖液。取0. 5mL酶液，用50mM磷 酸緩沖液稀釋至lmL，分別取0. 2mL加入到蘇丹紅I、II、III、IV溶液中，溶液中蘇丹紅I、 II、III、IV最終濃度為10μg/mL，反應(yīng)液體積2mL。
[0034] (2)反應(yīng)液置于30°C振蕩器上恒溫孵化2天，HPLC檢測反應(yīng)液中蘇丹紅I、II、 III、IV終濃度。
[0035] (3)根據(jù)反應(yīng)液中最終蘇丹紅質(zhì)量，計算蘇丹紅降解率。
[0036] 圖1為蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III和蘇丹紅IV標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。分析條件：分 析色譜柱YMC-Pack0DS-A-HG(5μm，4. 6X250mm)，流速lmL/min，流動相為色譜級甲醇。分 析儀器：DI0NEXUltimate3000高效液相色譜儀，檢測波長478nm。
[0037] 圖2為來源于單色云芝（Coriolusunicolor)菌絲體的粗酶液經(jīng)硫酸銨40%、 60%、80%和90%分級沉淀后獲得的蛋白質(zhì)沉淀物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)成 像，可見40%部分顯示出分子量大小為55KD的主條帶，40%沉淀部位具有較強(qiáng)的多酚氧化 酶催化活性，且蛋白質(zhì)質(zhì)量分布范圍為50-85KD。
[0038] 表1 :酶制劑對蘇丹紅I、II、III、IV的降解率
[0039]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶制劑，其特征在于，該酶制劑包含分子量為50-85KD的蛋白酶。2. 權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于，所述的分子量為50-85KD的蛋白酶中包括多 酚氧化酶，所述的多酚氧化酶為分子量為55KD的蛋白酶。3. 權(quán)利要求1或2所述的酶制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將微生物菌種置于斜面培養(yǎng)基活化后置于無菌操作環(huán)境下，用接種針劃取0. 5 cmXO. 5cm的菌塊接種于預(yù)先設(shè)有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，置于轉(zhuǎn)速為120r/min的恒溫振 蕩器中，在28 °C下恒溫培養(yǎng)4天，得到種子液； (2) 將種子液轉(zhuǎn)入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在轉(zhuǎn)速為120r/min的丨旦溫振蕩器中，28 °C下恒溫培養(yǎng)7天；將培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心10min收集菌絲體； (3) 用50mM磷酸緩沖液清洗菌絲體后再在液氮下研磨至均一粉末，收集菌絲體粉末， 加入50mM磷酸緩沖液，置于10000rpm冷凍離心機(jī)中4 °C離心10min后取上清液即 為粗酶液；然后在上清液中加入硫酸銨至終濃度為40%wt，在4 °C下放置24h后置于 10000rpm冷凍離心機(jī)中4 °C離心10min，所得沉淀即為酶制劑。4. 權(quán)利要求3所述的酶制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中的微生物菌種 %爭色1云芝SCoriolus unicolor、。5. 權(quán)利要求3所述的酶制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中的斜面培養(yǎng)基 為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA)，即將200g/L的去皮土豆?jié){液與20g/L的葡萄糖和20g/L瓊 脂經(jīng)熱溶混勻制得，pH自然。6. 權(quán)利要求3所述的酶制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中的種子培養(yǎng)基 為馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB)，即將200g/L的去皮土豆?jié){液與20g/L的葡萄糖經(jīng)混合后制 得，pH自然。7. 權(quán)利要求3所述的酶制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng) 基為馬鈴薯基礎(chǔ)培養(yǎng)基（SPM)，即將200g/L的去皮土豆?jié){液與20g/L的葡萄糖，3g/L KH2P04,L5g/LMgS04 · 7H20和微量維生素B1經(jīng)混合后制得，pH6. 0。8. 權(quán)利要求3所述的酶制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（3)中的菌絲體與磷酸 緩沖液的添加體積比為，菌絲體濕重/磷酸緩沖液=1/1. 5。9. 權(quán)利要求4所述的微生物菌種單色云芝在降解蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇 丹紅IV中的一種或多種上的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的酶制劑在降解蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅 IV中的一種或多種上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降解蘇丹紅I,？II,？III,？IV的酶制劑及其制備方法。包括如下步驟：（1）將單色云芝菌株由斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入種子液中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入裝有基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)過濾得到菌絲體，菌絲體用磷酸緩沖液洗滌多次，隨后收集菌絲體，低溫保藏備用；（2）菌絲體加入液氮后研磨成均一粉末，加入磷酸緩沖液，離心后取上清液；（3）將上述粗酶液采用40%硫酸銨沉淀，離心得沉淀即為酶制品。本發(fā)明的產(chǎn)品酶制劑為天然來源的產(chǎn)物，具有工藝簡單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，制備的酶制劑可以有效降解蘇丹紅I,？II,？III,？IV染料，具有降解效率高，降解周期短，降解后的溶液成分簡單等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12R1/645, C12N9/02, A62D3/02, A62D101/28
【公開號】CN105274066
【申請?zhí)枴緾N201510611552
【發(fā)明人】鄧張雙, 周金山, 陳良立, 施亞群
【申請人】三峽大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年12月2日