用于木材加工的漆酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種用于木材加工的漆酶，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]木質(zhì)素酶是指能分解木質(zhì)素的一類酶的總稱，漆酶是木質(zhì)素酶中非常重要的一種，主要用于制漿造紙、酒精制備、粘膠纖維制備中的木質(zhì)素脫除和環(huán)境治理中的廢棄物和有害物質(zhì)的治理。木質(zhì)素是自然界中僅次于纖維素的第二大生物質(zhì)材料，在細(xì)胞壁中起著支撐細(xì)胞力學(xué)性能的作用，但在制漿造紙、酒精制備、粘膠纖維制備中，為了脫除木質(zhì)素留下有用的纖維素和半纖維素，多采用物理化學(xué)的方法將之除去。生物酶是一種能夠溫和、無(wú)污染的將木質(zhì)素有效去除方法，在利用生物酶將木質(zhì)素去除的過(guò)程中不會(huì)對(duì)纖維素、半纖維素等化學(xué)物質(zhì)造成任何損害。但木質(zhì)材料不僅具有自己特殊的化學(xué)成分，均能對(duì)生物酶產(chǎn)生抑制作用，還有自己特有的酸堿環(huán)境，也會(huì)對(duì)生物酶產(chǎn)生不利影響。內(nèi)生菌是一種完全適應(yīng)植物內(nèi)部酸堿環(huán)境和化學(xué)成分的一類特殊的微生物，其在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中與其宿主植物協(xié)同進(jìn)化，所以從植物內(nèi)生菌中篩選出可以適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境，應(yīng)用于木材加工的高效漆酶。
[0003]本發(fā)明提供的用于木材加工的漆酶，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而是提供一種完全適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境、用于木材加工的漆酶。
[0005]本發(fā)明的用于木材加工的漆酶，如下步驟得到:
[0006]a.出發(fā)菌株:甲基營(yíng)養(yǎng)型芽抱桿菌 HS047 (Bacillus methylotrophicus HS047)，保藏編號(hào)CCTCC Ν0:Μ 2015032 ;保藏時(shí)間:2015年1月11日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國(guó)、武漢、武漢大學(xué)。
[0007]b.種子菌體培養(yǎng)
[0008]種子培養(yǎng)基組成:以g/1000ml計(jì)，愈創(chuàng)木酚5g，酵母粉5g，麥芽粉3g，瓊脂粉14g，KC1 0.3g，NaN03 0.2g，CaS04 0.5g，MgC03 0.lg,用蒸饋水配至 1000ml，用滅菌鍋在121°C條件下滅菌30min后，用傾斜法倒至經(jīng)滅菌鍋121°C條件下滅菌60min并已干燥的培養(yǎng)皿中；
[0009]種子菌體培養(yǎng):待種子培養(yǎng)基冷卻，將經(jīng)紫外光照射60min或不經(jīng)紫外光照射的菌株用竹簽接種于培養(yǎng)皿的種子培養(yǎng)基上，25-30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用于種子菌體的培養(yǎng)；
[0010]C.發(fā)酵培養(yǎng)
[0011]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，以g/1000ml計(jì)，愈創(chuàng)木酚5g，酵母粉5g，麥芽粉3g，NaCl0.5g，CaS04 0.l，GeS04 0.1-0.5g用蒸饋水配至1000ml ;后分裝于250ml的錐形瓶中，每瓶裝200ml的培養(yǎng)基，在121°C條件下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后；將b步驟的菌齡為24h的菌體，用竹簽接種1板至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床溫度25-30°C、轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵24h得到漆酶的粗酶液；將漆酶粗酶液利用離心機(jī)和超濾膜初步分離純化后，利用分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試；
[0012]本發(fā)明的用于木材加工的漆酶，其漆酶的性能參數(shù)為:最適使用溫度為55°C、最適pH值為4.5-6.5、當(dāng)儲(chǔ)存溫度彡4°C，儲(chǔ)存時(shí)間為24-96h ;當(dāng)儲(chǔ)存溫度為37°C或60°C或室溫時(shí)，儲(chǔ)存時(shí)間為48h。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0014]1、利用完全適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境的內(nèi)生菌為出發(fā)菌株，制備出在pH值4.5-6.5環(huán)境能夠充分發(fā)揮漆酶活性的漆酶溶液，對(duì)于實(shí)現(xiàn)、促進(jìn)木質(zhì)材料的生物加工奠定基礎(chǔ)。
[0015]2、能高效用于木材加工的漆酶，對(duì)于實(shí)現(xiàn)生物制漿、綠色纖維分離和生物紡織均具有一定的推動(dòng)和促進(jìn)作用。
【具體實(shí)施方式】
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[0016]實(shí)施例1:
[0017]本發(fā)明的一種用于木材加工的漆酶，經(jīng)如下步驟得到:
[0018]a.出發(fā)菌株:甲基營(yíng)養(yǎng)型芽抱桿菌 HS047 (Bacillus methylotrophicus HS047)，保藏編號(hào)CCTCC Ν0:Μ 2015032 ;保藏時(shí)間:2015年1月11日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國(guó)、武漢、武漢大學(xué)。
[0019]b.種子菌體培養(yǎng)
[0020]種子培養(yǎng)基組成:以g/1000ml計(jì)，愈創(chuàng)木酚5g，酵母粉5g，麥芽粉3g，瓊脂粉14g，KC1 0.3g，NaN03 0.2g，CaS04 0.5g，MgC03 0.lg,用蒸饋水配至 1000ml，用滅菌鍋在121 °C條件下滅菌30min后，用傾斜法倒至經(jīng)滅菌鍋121 °C條件下滅菌60min并已干燥的培養(yǎng)皿中；
[0021]種子菌體培養(yǎng):待種子培養(yǎng)基冷卻，將菌體用竹簽接種于培養(yǎng)皿的種子培養(yǎng)基上，在30 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用于種子菌體的培養(yǎng)；
[0022]c.發(fā)酵培養(yǎng)
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，以g/1000ml計(jì)，愈創(chuàng)木酚5g，酵母粉5g，麥芽粉3g，NaCl0.05g，CaS04 0.1，GeS04 0.lg用蒸饋水配至1000ml ;后分裝于250ml的錐形瓶中，每瓶裝200ml的培養(yǎng)基，在121°C條件下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后；將b步驟的菌齡為24h的菌體，用竹簽接種1板至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床溫度25°C、轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵24h得到漆酶的粗酶液；將漆酶粗酶液利用離心機(jī)和超濾膜初步分離純化后，利用常規(guī)分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試，漆酶酶活(u/ml)為17.63±0.4。
[0024]實(shí)施例2:
[0025]基本同實(shí)施例1。不同之處為:菌株經(jīng)過(guò)了 60min的紫外光照射，發(fā)酵液中添加GeS04 0.25go利用常規(guī)分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試，漆酶酶活(u/ml)為28.73±0.6o
[0026]實(shí)施例3:
[0027]基本同實(shí)施例1。不同之處為:發(fā)酵液中添加GeS04 0.35g。利用常規(guī)分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試，漆酶酶活(u/ml)為20.19±0.7。
[0028]實(shí)施例4:
[0029]基本同實(shí)施例1。不同之處為:菌株經(jīng)過(guò)60min紫外光照射，發(fā)酵液中添加GeS040.40go利用常規(guī)分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試，漆酶酶活(u/ml)為180.09±0.9。
[0030]實(shí)施例5:
[0031]基本同實(shí)施例1。不同之處為:菌株經(jīng)過(guò)60min紫外光照射，發(fā)酵液中添加CaS040.45go利用常規(guī)分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試，漆酶酶活(u/ml)為219.03±1.2。
[0032]實(shí)施例6:
[0033]基本同實(shí)施例1。不同之處為:菌株經(jīng)過(guò)60min紫外光照射，添GeS04 0.50g。利用常規(guī)分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試，漆酶酶活(u/ml)為196.09±1.1。
[0034]發(fā)明人將上述實(shí)施例得到的漆酶，用常規(guī)分光光度計(jì)法在不同溫度、不同pH值、不同儲(chǔ)存溫度下測(cè)試漆酶的酶活，得到漆酶的性能參數(shù)為:最適使用溫度為55°C、最適pH值為4.5-6.5、在溫度4°C或以下溫度儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間為24-96h ;在37°C、60°C或常溫等條件下儲(chǔ)存時(shí)，儲(chǔ)存時(shí)間不能超過(guò)48h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于木材加工的漆酶，其特征在于該漆酶經(jīng)如下步驟得到: a.出發(fā)菌株:甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)HS047，保藏編號(hào)CCTCC Μ 2015032 ； b.種子菌體培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基組成:以g/1000ml計(jì)，愈創(chuàng)木酚5g，酵母粉5g，麥芽粉3g，瓊脂粉14g，KC10.3g, NaN030.2g, CaS040.5g，MgC030.lg,用蒸饋水配至 1000ml，用滅菌鍋在 121°C條件下滅菌30min后，用傾斜法倒至經(jīng)滅菌鍋121°C條件下滅菌60min并已干燥的培養(yǎng)皿中； 種子菌體培養(yǎng):待種子培養(yǎng)基凝固冷卻至20-25°C，將菌體用竹簽接種于培養(yǎng)皿的種子培養(yǎng)基上，在25-30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用于種子菌體的培養(yǎng)； c.發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，以g/1000ml計(jì)，愈創(chuàng)木酚5g，酵母粉5g,麥芽粉3g, NaCl 0.5g，CaS040.lg, GeS040.1-0.5g，用蒸饋水配至1000ml ;后分裝于250ml的錐形瓶中，每瓶裝200ml的培養(yǎng)基，在121°C條件下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后；將b步驟的菌齡為24h的菌體，用竹簽接種1板至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床溫度25°C、轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵24h得到漆酶的粗酶液；將漆酶粗酶液利用離心機(jī)和超濾膜初步分離純化后，利用分光光度計(jì)法進(jìn)行漆酶酶活的測(cè)試。2.權(quán)利要求1所述的用于木材加工的漆酶，其特征在于該漆酶的性能參數(shù)為:最適使用溫度為55°C、最適pH值為4.5-6.5、當(dāng)儲(chǔ)存溫度彡4°C，儲(chǔ)存時(shí)間為24_96h ;當(dāng)儲(chǔ)存溫度為37°C或60 °C或室溫時(shí)，儲(chǔ)存時(shí)間為48h。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于木材加工的漆酶，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用保藏編號(hào)CCTCC？M？2015032的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus？methylotrophicus)HS047，通過(guò)種子菌體培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到用于木材加工的漆酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、利用完全適應(yīng)植物內(nèi)部環(huán)境的內(nèi)生菌為出發(fā)菌株，制備出在pH值4.5-6.5環(huán)境能夠充分發(fā)揮漆酶活性的漆酶溶液，對(duì)于實(shí)現(xiàn)、促進(jìn)木質(zhì)材料的生物加工奠定基礎(chǔ)；2、能高效用于木材加工的漆酶，對(duì)于推動(dòng)漆酶在木材加工、制漿造紙中的應(yīng)用均具有一定的推動(dòng)和促進(jìn)作用。CCTCCNO: M 201503220150111
【IPC分類】C12N9/02, C12R1/07
【公開(kāi)號(hào)】CN105274067
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510793743
【發(fā)明人】李曉平, 吳章康, 杜官本, 吳寧
【申請(qǐng)人】西南林業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月18日