一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶（Creatinase，EC3. 5. 3. 3,簡稱 CRE)突變體，屬于酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌酸水解酶是酶促檢測法中檢測肌酐的一種必不可少的酶，主要來源與微生物。 在一些研究中發(fā)現(xiàn)一些屬的菌株能夠通過誘導(dǎo)產(chǎn)生肌酸水解酶并在細(xì)胞中積累。這些細(xì)菌 有假單胞菌屬、梭菌、黃桿菌屬、芽孢菌屬、產(chǎn)堿菌屬等等。但由于原始菌的肌酸水解酶產(chǎn)量 很低，且誘導(dǎo)劑的價(jià)格較高，不適合進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。同時(shí)，對(duì)肌酸水解酶的性質(zhì)分 析發(fā)現(xiàn)其具有底物親和力低，熱穩(wěn)定性差等特點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中就需要有大量的酶，不利于 工業(yè)生產(chǎn)。
[0003] 目前對(duì)肌酸水解酶性質(zhì)分析比較深入的菌株主要是惡臭假單胞菌、節(jié)桿菌和產(chǎn) 堿桿菌。綜合分析不同來源的肌酸水解酶學(xué)性質(zhì)，多數(shù)肌酸水解酶的最適反應(yīng)pH范圍為 7. 0~8. 0,在中性、弱堿和弱酸條件下保持穩(wěn)定。已報(bào)道的肌酸水解酶的最適反應(yīng)溫30~ 4 0 °C，而熱穩(wěn)定性不是很理想，在4 5 °C以下相對(duì)穩(wěn)定，溫度一旦高于4 5 °C，酶活會(huì)迅速下 降。因此，對(duì)肌酸水解酶的熱穩(wěn)定性研究很有必要。本發(fā)明通過定點(diǎn)突變的方式將肌酸酶 分子內(nèi)部疏水性的氨基酸纈氨酸突變成疏水性強(qiáng)的蛋氨酸，改變了分子內(nèi)部疏水性，顯著 提高菌株的熱穩(wěn)定性，更適合工業(yè)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的問題是提供一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體。
[0005] 所述突變體是對(duì)肌酸水解酶氨基酸序列的第368位氨基酸進(jìn)行突變。
[0006] 所述肌酸水解酶氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0007] 所述肌酸水解酶核苷酸序列是SEQIDN0. 2所示的序列。
[0008] 所述肌酸水解酶來源于大腸桿菌。
[0009] 所述突變體是將第368位的纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼幔玫酵蛔凅wV368M。
[0010] 本發(fā)明還提供一種表達(dá)所述突變體的基因工程菌。
[0011] 所述基于工程菌為大腸桿菌。
[0012] 所述肌酸水解酶在測定人體肌酐含量、評(píng)價(jià)人體腎臟功能中的應(yīng)用。
[0013] 所述突變是對(duì)來源于大腸桿菌的肌酸水解酶蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，從 而提高了肌酸酶的熱穩(wěn)定性。
[0014] 有益效果：
[0015] 相對(duì)于現(xiàn)有的突變體V368M的半衰期提高了 5倍，其Tm值提高了 3°C。
[0016] 說明書附圖
[0017] 圖1 :溫度對(duì)CRE活性和穩(wěn)定性的影響
[0018] 圖2 :突變體Tm值測定。
【具體實(shí)施方式】
[0019] LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L。
[0020] TB培養(yǎng)基：蛋白胨 12g/L、酵母粉 24g/L、甘油 10g/L、ΚΗ2Ρ04 2. 32g/L、Κ2ΗΡ04 16.43g/L〇
[0021] 采用分光光度法測定肌酸水解酶酶活。單位酶活定義：lmin內(nèi)將肌酸水解產(chǎn)生 1ymol尿素所需要的酶量。酶活測定條件為：在試管中加入900uL肌酸溶液，在室溫中平衡 5min。后加入100uL待測酶液，在37°C反應(yīng)lOmin，然后向反應(yīng)體系中加入2mL對(duì)-二甲胺 基苯甲醛溶液終止反應(yīng)，并置于25°C溫育20min，在435nm處測定吸光度值，以水調(diào)零?？瞻?管是在肌酸溶液中先加入對(duì)-二甲氨基苯甲醛，后加入待測酶液，其它步驟與測定管一致。
[0022] 實(shí)施例1高熱穩(wěn)定性突變菌株的獲得
[0023] 利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖校═aKaRa)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物（如表1所示），以已構(gòu)建好的 PET20J為模板，進(jìn)行PCR，將肌酸水解酶分子內(nèi)部第358位的纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼幔?為V368M，PCR反應(yīng)條件為 98°C3min，34 個(gè)循環(huán)（98°C3min、58°C30S、72°Clmin30S)、 72°C10min。PCR擴(kuò)增體系：模板1μ1、上下游引物各1μl，2xPrimeStar24μ1、滅菌的雙 蒸水24μ1。PCR結(jié)束后，加入5μ1的FDbuffer、1μ1的Dpnl消化lh。采用膠回收試劑 盒對(duì)消化完的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收、轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子有上海生工進(jìn)行測序。測序正確的 轉(zhuǎn)化子命名為Pet20J-V368M。
[0024] 表 1
[0025]
[0026] 實(shí)施例2高熱穩(wěn)定性肌酸水解酶突變株的驗(yàn)證
[0027] 將測序正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)化至TB培養(yǎng)基，接種量為3%。菌體長到0D600為3時(shí)，加入IPTG，使其終濃 度為0.6mmol/L，并將培養(yǎng)溫度降到30°C，培養(yǎng)8h。收集發(fā)酵后的菌體。超生破碎后測定 相同溫度下保溫不同時(shí)間的酶活。
[0028] 實(shí)施例3肌酸水解酶的純化
[0029] 破碎大腸桿菌后進(jìn)行硫酸銨沉淀，選擇55 % -75 %硫酸銨飽和度的沉淀，用少量 磷酸鹽緩沖液（PH7.0)溶解蛋白沉淀，透析24h除去酶液中的硫酸銨。根據(jù)肌酸水解酶的 等電點(diǎn)性質(zhì)，選擇QFF柱進(jìn)行離子交換純化。QFF柱以磷酸鹽緩沖液平衡30min，將粗酶液 注入純化柱中，用含有1MNaCl的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
[0030] 實(shí)施例4肌酸水解酶純酶液性質(zhì)測定
[0031] 將純化后的肌酸水解酶稀釋，測定在50°C下保溫0、5、15、20、25、30min的殘余酶 活。發(fā)現(xiàn)Pet20J(WT)在保溫10min后其殘余酶活僅為8. 3%，而突變體pET20J-V368M保 溫10min后其殘余酶活為76. 4% (如圖1所示）。通過計(jì)算，WT的半衰期為2. 3min，而突 變體V368M的半衰期為11. 6min，提高了 5倍。其次，用DSC測其Tm值，突變體較WT提高了 3°C(如圖2所示）。
[0032] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熱穩(wěn)定性提高的突變體，其特征在于：所述突變體是將肌酸水解酶氨基酸序列 的第368位氨基酸突變成蛋氨酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熱穩(wěn)定性提高的突變體，特征在于，所述肌酸水解酶氨 基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熱穩(wěn)定性提高的突變體，特征在于，所述肌酸水解酶核 苷酸序列是SEQIDNO. 2所示的序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種熱穩(wěn)定性提高的突變體，特征在于，所述肌酸水解酶 來源于大腸桿菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熱穩(wěn)定性提高的突變體，特征在于，所述突變體是將第 368位的纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼?，得到突變體V368M。6. 能夠表達(dá)權(quán)利要求1所述突變體的基因工程菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體，屬于酶工程領(lǐng)域，所述突變體是對(duì)肌酸水解酶氨基酸序列的第368位氨基酸進(jìn)行突變。所述肌酸水解酶來源于大腸桿菌。所述突變體是將第368位的纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼?，得到突變體V368M。所述突變是對(duì)來源于大腸桿菌的肌酸水解酶蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而提高了肌酸酶的熱穩(wěn)定性。相對(duì)于現(xiàn)有的突變體V368M的半衰期提高了5倍，其Tm值提高了3℃。
【IPC分類】C12N1/21, C12N9/78, C12R1/19
【公開號(hào)】CN105274080
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510766758
【發(fā)明人】陳堅(jiān), 劉松, 阮潔, 馮岳, 李江華, 陳雙全, 邱芳芳, 王晨蕾
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月11日