一種表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的rev病毒傳染性克隆的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒傳染性克隆的構(gòu)建方法。 此發(fā)明不僅可獲得表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV示蹤病毒，填補(bǔ)了國內(nèi)外空白；為研 究REV病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制，組織嗜性及其致病機(jī)理提供了材料；同時為開發(fā)REV作為病毒載 體表達(dá)外源基因提供了可能。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV)主要引起以網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生為主要特征的 一組綜合征，包括急性網(wǎng)狀細(xì)胞增生癥、矮小綜合征和淋巴組織及其它組織的慢性腫瘤增 生性疾病。REV感染雞群往往生長遲緩，淘汰率和死亡率升高；并引起感染雞的免疫抑制， 干擾其它禽病疫苗的免疫效應(yīng)，導(dǎo)致免疫失敗。該病目前已呈世界范圍流行，但對其細(xì)胞感 染受體、病毒復(fù)制位點(diǎn)及其致病機(jī)理等方面知之甚少。構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白的示蹤病毒 已被廣泛應(yīng)用于病毒受體、組織嗜性及其致病機(jī)理等研究中。國內(nèi)外學(xué)者也嘗試將綠色熒 光蛋白基因插入REV基因組，拯救表達(dá)綠色熒光蛋白的REV示蹤病毒，但由于選擇的插入位 點(diǎn)的不適宜目前尚未成功獲得表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒。本研究將綠色熒光 EGFP基因，利用商品化的重組酶ExnaseTMII，插入到REV病毒基因組合適的插入位點(diǎn)，構(gòu) 建并成功拯救出了表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是在于構(gòu)建表達(dá)綠色熒光囊膜蛋白的REV病毒傳染性克隆，并拯救 出相應(yīng)病毒。本發(fā)明的原理和最核心的關(guān)鍵技術(shù)是科學(xué)地設(shè)計引物擴(kuò)增出含REV傳染性 線性化載體以及EGFP基因片段，利用商品化的重組酶ExnaseTMII不經(jīng)酶切連接反應(yīng)，將 EGFP基因片段插入到REV傳染性克隆env基因的N端，在體外快速重組克隆，并將陽性克隆 轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞拯救出表達(dá)綠色熒光囊膜蛋白的REV病毒。
[0004] 所述引物如下：
[0005] a，PCR擴(kuò)增出REV傳染性克隆SNV線性化載體；
[0006] 上游引物：5'CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3,(SEQIDNO. 1);
[0007]下游引物：5'GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3,(SEQIDNO.2)。
[0008] b，PCR擴(kuò)增出綠色熒光蛋白基因EGFP;
[0009] 上游引物：5，CAGGCGAGCAAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG3'（SEQIDNO. 3);
[0010] 下游引物：5，CACAAGGAGAATTAGCTTGTACAGCTCGTCCAT3，(SEQIDNO.4)〇
[0011] 本發(fā)明公開了PCR擴(kuò)增REV傳染性克隆SNV線性化載體以及PCR擴(kuò)增EGFP基因， 用于構(gòu)建表達(dá)綠色熒光囊膜蛋白的REV傳染性克隆的引物序列。本發(fā)明還公開了一種基于 REV病毒LTR的外源基因快速構(gòu)建表達(dá)綠色熒光囊膜蛋白的REV傳染性克隆的方法，是用重 組酶ExnaseTMII，將線性化的REV傳染性克隆載體與EGFP基因片段PCR產(chǎn)物不經(jīng)酶切連 接反應(yīng)，直接重組克隆獲得表達(dá)綠色熒光囊膜蛋白的REV傳染性克隆。
[0012] 本發(fā)明一種表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒傳染性克隆的構(gòu)建方法，包括 以下步驟：
[0013] 1)利用序列如SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2的引物，以REV傳染性克隆質(zhì)粒SNV 質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出SNV線性化載體；
[0014] 2)利用序列如SEQIDN0. 3和SEQIDN0. 4引物，以pcDNA3. 1-EGFP質(zhì)粒為模板， PCR擴(kuò)增出綠色熒光蛋白基因EGFP;
[0015] 3)利用重組酶ExnaseTMII對步驟1)和2)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速重組克?。?陽性克隆轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞拯救出表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒。
[0016] 本發(fā)明表達(dá)綠色熒光囊膜蛋白的REV傳染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救；分別以含 REV病毒前病毒全基因組質(zhì)粒SNV以及含EGFP基因質(zhì)粒為模版，PCR分別擴(kuò)增出REV傳染 性克隆線性化載體以及EGFP基因片段（附圖1，步驟1);并利用重組酶ExnaseTMII進(jìn)行 快速重組克?。ǜ綀D1，步驟2);陽性克隆即可進(jìn)行DF1細(xì)胞轉(zhuǎn)染、拯救病毒（附圖1，步驟 3) 〇
[0017] 利用本發(fā)明設(shè)計的引物，通過重組酶ExnaseTMII可以快速獲得含有EGFP基因片 段的REV傳染性克隆質(zhì)粒。該克隆方法不依賴于限制性內(nèi)切酶以及連接酶，大大簡化了含 EGFP基因片段的REV傳染性克隆的構(gòu)建過程，提高了效率。獲得的含EGFP基因片段的REV 傳染性克隆轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，即可獲得表達(dá)綠色熒光囊膜蛋白的REV病毒。獲得表達(dá)綠色熒 光囊膜融合蛋白的REV示蹤病毒，填補(bǔ)了國內(nèi)外空白；為研究REV病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制，組織 嗜性及其致病機(jī)理提供了材料；同時為開發(fā)REV作為病毒載體表達(dá)外源基因提供可能。
【附圖說明】
[0018] 圖1表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV傳染性克隆構(gòu)建及病毒拯救策略
[0019] 步驟1 :以含REV病毒前病毒全基因組質(zhì)粒SNV以及含EGFP基因的pcDNA3. 1-EGFP 為模版，利用表1中相應(yīng)引物，PCR分別擴(kuò)增出線性化REV傳染性克隆載體以及EGFP基因 片段；步驟2 :利用重組酶ExnaseTMII進(jìn)行快速重組克??；步驟3 :陽性克隆轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞 拯救病毒。
[0020] 圖2PCR擴(kuò)增線性化REV載體和EGFP片段
[0021] 泳道1，1kbMarker;泳道2，擴(kuò)增出的線性化REV傳染性克隆載體；泳道3，擴(kuò)增出 的EGFP片段。
[0022] 圖3PCR鑒定含EGFP的REV傳染性克隆
[0023] 泳道1-6,PCR擴(kuò)增REV載體片段；泳道M，lkbMarker;泳道7-12,PCR擴(kuò)增EGFP 片段。
[0024] 圖4表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒拯救效果
[0025] A，轉(zhuǎn)染含EGFP的REV傳染性克隆5天后的熒光；B，第一代傳代細(xì)胞觀察到的熒 光；C，第三代傳代細(xì)胞觀察到的熒光；D，第五代傳代細(xì)胞觀察到的熒光。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，以下實(shí)施方式結(jié)合附圖展示表達(dá)綠色熒光囊膜融合 蛋白的REV傳染性克隆的構(gòu)建及其病毒拯救。
[0027] 實(shí)施例：
[0028] 1)設(shè)計擴(kuò)增REV傳染性克隆線性化載體以及EGFP基因片段引物：擴(kuò)增REV傳染性 克隆線性化載體上游引物位于SNV毒株前病毒基因組6112-6141位；擴(kuò)增含REV病毒LTR 的線性化載體下游引物位于SNV毒株前病毒基因組6082-6111位；擴(kuò)增EGFP基因的上游引 物中除了自EGFP基因ATG起始的18個EGFP基因特異的堿基外，在其5端還帶有15個與 擴(kuò)增REV傳染性克隆線性化載體下游引物反向互補(bǔ)的堿基；擴(kuò)增EGFP基因的下游引物中除 了EGFP基因3末端特異的18個堿基外，帶有15個保守的與擴(kuò)增含REV傳染性克隆線性化 載體上游引物互補(bǔ)的堿基。具體引物序列見附表1，由LifeTechnologies上海賽默飛世爾 科技公司合成。
[0029] 表1REV線性化載體和EGFP基因引物設(shè)計
[0030]
[0031] 2)REV線性化載體以及EGFP片段PCR擴(kuò)增：以含REV病毒前病毒全基因組質(zhì)粒SNV 以及pcDNA3. 1-EGFP為模版，表1所述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖1中的步驟1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：40μ1水，5μ1 10倍緩沖液，ΙμL10mMdNTP，lylΙΟμ mol上游引物， 1μ1 10μL?ο?下游引物，1μ1long/μ1的SNV以及pcDNA3. 1-EGFP，1μ1商品化的Phanta Super-FidelityDNA聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95°C變性3分鐘，隨后進(jìn)行30個 循環(huán)（95°C變性10秒，57°C退火30秒，72°C延伸3分鐘），最后72°C延伸10分鐘。PCR結(jié) 束后，PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。如圖2所示，其中泳道1表示對照品DNA Marker的電泳分析圖，其中泳道2和3分別代表基于REV線性化載體以及EGFP基因片段 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖。
[0032] 3)EGFP片段快速克隆進(jìn)REV傳染性克隆載體：將以上純化的REV線性化載體以及 EGFP片段PCR產(chǎn)物在商品化重組酶ExnaseTMII的作用下進(jìn)行重組克隆。如圖1中的步 驟2。具體重組反應(yīng)體系如下：純化的EGFP產(chǎn)物50-100ng，純化的REV線性化載體50ng， 2μ1商品化的ExnaseTMII酶，4μ1 5倍的緩沖液，其它補(bǔ)加水至20μ1。反應(yīng)物于37°C 作用30分鐘后，置冰上5分鐘。隨后將20μ1反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到常規(guī)感受態(tài)細(xì)菌，涂LB板。次 日挑取細(xì)菌克隆進(jìn)行質(zhì)粒制備，陽性克隆鑒定，如圖3所示。
[0033] 4)表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒的拯救與鑒定：將獲得的含EGFP的陽 性克?。麨镽EV-EGFP)轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12hr后，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表 達(dá)。如圖1中的步驟3。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：取2μg的REV-LTR-eGFP質(zhì)粒加入到50μ1 的0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，隨后與4μ1的Mirus轉(zhuǎn)染試劑混勻；室溫放置45min后，加入450μ1 的0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基混勻后，直接加到新鮮培養(yǎng)的貼壁的DF1。轉(zhuǎn)染5天后觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染的 DF1細(xì)胞中僅可見少量表達(dá)EGFP的細(xì)胞（如圖4Α)。隨即將細(xì)胞進(jìn)行了消化傳代。在第一 代培養(yǎng)到5天時，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有少量成簇的特異的綠色熒光（如圖4B)。這一結(jié) 果提示我們已經(jīng)拯救獲得表達(dá)EGFP的REV病毒。為進(jìn)一步確定該病毒的穩(wěn)定性，對該表達(dá) EGFP的REV病毒進(jìn)行了繼續(xù)傳代，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該病毒可穩(wěn)定表達(dá)EGFP綠色熒光 (如圖4D)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒傳染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于包 括以下步驟： 1) 利用下述引物，以REV傳染性克隆質(zhì)粒SNV質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出SNV線性化載 體； 上游引物：5' CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3'; 下游引物：5' GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3'。 2) 利用下述引物，以pcDNA3. 1-EGFP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出綠色熒光蛋白基因EGFP ; 上游引物：5, CAGGCGAGCAAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG3 ^ ; 下游引物：5' CACAAGGAGAATTAGCTTGTACAGCTCGTCCAT3'。 3) 利用重組酶ExnaseTM II對步驟1)和2)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速重組克??；陽性 克隆轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞拯救出表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒傳染性克隆的構(gòu)建方法，是將特定PCR引物擴(kuò)增出的綠色熒光EGFP基因片段，插入到線性化的REV病毒基因組Env基因的N端，利用商品化的重組酶ExnaseTM？II不經(jīng)酶切連接反應(yīng)，直接在體外快速重組克隆，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增與鑒定；并將陽性克隆轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，拯救獲得表達(dá)綠色熒光囊膜融合蛋白的REV病毒。
【IPC分類】C12N15/63, C12N15/10
【公開號】CN105274089
【申請?zhí)枴緾N201510802359
【發(fā)明人】葉建強(qiáng), 周曉祥, 秦愛建, 邵紅霞
【申請人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月19日