一種控制玉米雄性生育力的ZmMs7基因序列及其編碼蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種控制玉米雄性生育力的基因序列及其蛋白編碼序列，屬于基因工 程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物雄性不育（malesterility,MS)是一種高等植物中普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象， 指在雌雄同株植物中，雄蕊發(fā)育異常，不能產(chǎn)生有功能的花粉，但雌蕊發(fā)育正常并能受精結(jié) 實(shí)，并且這種雄性不育性狀可在后代中遺傳。植物的雄性不育按照其遺傳方式可分為細(xì)胞 核雄性不育、細(xì)胞質(zhì)雄性不育及核質(zhì)互作不育。其中，細(xì)胞核雄性不育表現(xiàn)為核遺傳，因而 其不育性表現(xiàn)穩(wěn)定，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有巨大應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)植物生物技術(shù)可以創(chuàng)制一種保 持和繁殖玉米雄性不育系的技術(shù)體系，從而實(shí)現(xiàn)玉米不育化雜交育種和制種。在雜交玉米 制種過(guò)程中，利用玉米雄性不育系可以節(jié)省大量人工去雄成本并保證種子純度。
[0003] 本發(fā)明提供了一種控制玉米雄性生育力的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，該基 因的功能缺失會(huì)造成玉米的雄花敗育，由此可以生產(chǎn)新的雄性不育材料，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有 十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種新的控制玉米雄性生育力基因及其編碼的蛋白序列，所述 基因是一種玉米雄穗特異性表達(dá)基因，所述基因功能的缺失會(huì)特異性導(dǎo)致玉米的雄花不 育。
[0005] 本發(fā)明第一個(gè)發(fā)明目的是：提供一種控制玉米雄性生育力的基因，其特征在于，是 選自如下1)或2)或3)或4)或5)所示的DNA分子： 1) SEQIDNO. 1所示的DNA分子(克隆自玉米自交系B73的基因組DNA); 2) SEQIDN0. 2所示的DNA分子(克隆自玉米自交系B73的cDNA); 3) 在SEQIDNO. 1基礎(chǔ)之上經(jīng)過(guò)一至數(shù)個(gè)堿基替換和\或一至數(shù)個(gè)堿基的插入和 \或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位所形成能夠影響玉米生育能力 的DNA分子； 4) 在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、(X1%SDS(w/v)的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜， 能夠與SEQIDN0. 2的DNA分子雜交且編碼植物花粉發(fā)育相關(guān)蛋白的DNA分子； 5) 與SEQIDN0. 2的DNA分子具有85%以上的同源性且編碼植物花粉發(fā)育相關(guān)蛋白 的DNA分子。
[0006] 本發(fā)明第二個(gè)發(fā)明目的是：提供上述基因編碼的植物花粉發(fā)育相關(guān)蛋白。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述基因編碼如下1)或2)所述的蛋白質(zhì)： 1)SEQIDN0. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2) 將SEQIDN0. 3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有 植物雄性育性相關(guān)活性的蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明第三個(gè)發(fā)明目的是：提供在花器官中調(diào)節(jié)所述基因序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動(dòng) 子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列如SEQIDN0. 4所示DNA序列，該序列具有在花 器官中特異啟動(dòng)如SEQIDN0. 1、2所述基因序列轉(zhuǎn)錄的功能。
[0008] 本發(fā)明第四個(gè)發(fā)明目的是：提供含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞系或重組菌。
[0009] 本發(fā)明第五個(gè)發(fā)明目的是：提供上述基因在用于轉(zhuǎn)基因改良作物的用途； 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因用于誘導(dǎo)作物植株雄性不育，以便導(dǎo)入外源基因以獲得 優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因作物； 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述改良包括產(chǎn)量提高、品質(zhì)提高、抗病蟲(chóng)害、抗逆、抗倒伏等 生長(zhǎng)性狀的改良； 在另一具體實(shí)施方案中，所述作物是自花授粉或異花授粉作物； 在一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，所述作物是玉米、小麥、水稻。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明涉及的基因是在玉米雄穗 中特異表達(dá)基因，該基因在控制玉米花粉發(fā)育中有重要作用，該基因功能的缺失會(huì)特異性 導(dǎo)致玉米的雄性不育，可通過(guò)抑制該基因的特異表達(dá)獲得新的玉米雄性不育系，在農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用潛力。
[0011] 術(shù)語(yǔ)定義 術(shù)語(yǔ)"調(diào)控玉米雄性生育力的基因"指一段具有編碼蛋白能力的核苷酸序列，該序列特 異編碼具有調(diào)控玉米花粉發(fā)育功能的蛋白活性多肽，如SEQIDN0. 2的第1-2013位核苷 酸序列及其簡(jiǎn)并序列。
[0012] 術(shù)語(yǔ)"簡(jiǎn)并序列"是指，位于SEQIDN0. 2的編碼框第1-2013位核苷酸序列中， 有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子 的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDN0. 2的第1-2013位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列 也能編碼出SEQIDN0. 2所編碼的氨基酸序列。
[0013] 所述"調(diào)控玉米雄性生育力的基因"，還包括在中度嚴(yán)格條件下，更佳的在高度嚴(yán) 格條件下可以與SEQIDN0. 2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，中等嚴(yán)格條件可以 是0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1%SDS(w/v)的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜的條件。
[0014] 所述"調(diào)控玉米雄性生育力的基因"，還包括與SEQIDN0. 2中從第1-2013位核 苷酸序列的同源性至少70%，較佳地具有至少80%、82%、85%、86%、88%、89%同源性，更佳地具 有至少90%、91%、92%、93%、94%同源性，最佳地具有至少95%、96%、97%、98%、99%同源性的核 苷酸序列。
[0015] 所述"調(diào)控玉米雄性生育力的基因"，還包括能編碼具有與天然的調(diào)控玉米花粉發(fā) 育基因ZMfe堪因相同功能蛋白的、SEQIDN0. 2開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異 形式包括(但并不限于）個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'或3'端添 加幾個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核 苷酸。
[0016] 所述"調(diào)控玉米雄性生育力的基因"，還包括能夠翻譯一類(lèi)具備調(diào)控玉米花粉發(fā)育 功能的氨基酸序列，如SEQIDN0. 3的氨基酸序列。該類(lèi)氨基酸序列還包括具有與天然調(diào) 控玉米花粉發(fā)育蛋白相同功能的SEQIDN0. 3的變異形式。這些變異形式包括(但并不限 于）個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或幾 個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi)）氨基酸。在本領(lǐng)域中，用性 能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能；在C末端和/或N末端添 加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。
[0017] 另外，所述的"調(diào)控玉米花粉發(fā)育基因"的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用 PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本實(shí)施例公開(kāi)的有關(guān) 核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員 己知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要 進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得 了有關(guān)的序列，可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，然后細(xì)胞 轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法從增殖的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變 引入實(shí)施例蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，實(shí)施例蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò) 直接合成多肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用人工或自動(dòng)進(jìn)行，可以分別化學(xué)合成 實(shí)施例蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)分子。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為野生型和玉米突變體獻(xiàn)?舶小花在抽雄期的形態(tài)觀察示意圖：圖A， 正常可育植株（WT)的小花和不育突變體（as7-份形7)的小花形態(tài)比較；圖B，可育株（WT)和 突變體（^?7-份形7)的花藥經(jīng)1%1(1-12染色結(jié)果比較。
[0019] 圖2為野生型和玉米突變體??7-份形難]細(xì)胞學(xué)觀察示意圖：圖A，正常可育植株 (WT)早期大液泡小孢子期花藥的小孢子細(xì)胞結(jié)構(gòu)；圖B，不育突變體（as7-份形7)早期大液 泡小孢子期花藥的小孢子細(xì)胞結(jié)構(gòu)；白色三角型標(biāo)示為萌發(fā)孔，黑色陰影箭頭標(biāo)示為細(xì)胞 壁，白色箭頭標(biāo)示處為細(xì)胞核，黑色標(biāo)尺代表30μm。
[0020] 圖3為因的遺傳和物理位置不意圖以及基因結(jié)構(gòu)不意圖：圖A， 基因的遺傳和物理位置示意圖；圖B，ZMfe堪因在野生型B73和玉米突變體人 份形沖的基因結(jié)構(gòu)（WT:野生型B73 ;灰色矩形內(nèi)的序列為份形7與野生B73的 ZMfe堪因?qū)?yīng)序列的比較結(jié)果；灰色直線和矩形均代表突變發(fā)生后受到影響的序列結(jié) 構(gòu)；TGA和TAA均為終止密碼子，表示蛋白的翻譯終止于此)，其中：序列表的SEQIDNO. 1 所示DNA分子由2435個(gè)核苷酸組成并具有如圖3.B中ZMfe7所示基因結(jié)構(gòu)，圖示的+ 1 至+ 2435對(duì)應(yīng)SEQIDNO. 1的1至2435bp堿基。+ 1至+ 321位為第一個(gè)外顯子，+ 322至+ 636位為第一個(gè)內(nèi)含子，+ 637至+ 918位為第二個(gè)外顯子，+ 919至+ 1025為第 二個(gè)內(nèi)含子，+1026至+ 2435為第三個(gè)外顯子。+1至+ 321 (321bp)、+ 637至+918 (282bp)