充分溶解（可放于-80°C長期保存）；
[0044] 12)紫外分光光度計及1 %Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量及大小，吸取 1μ1RNA加入3μ1的RNase-free水，加1μ1上樣緩沖液65°C變性5min。電泳后用EB染 色，另取3μ1的；
[0045] 13)RNA質量檢測：a)通過測定0D260、0D280、0D230的吸收值計算RNA的含量及 純度；b) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解；c)RNA直接進行PCR檢測是否存在DNA污 染。
[0046] 1. 2cDNA反轉錄
[0047]l)cDNA第一鏈的快速擴增
[0048]反轉錄酶：M-MLVReverseTranscriptase(Invitrogen)〇
[0049]
[0050] 2) 65°C變性5min，迅速插入冰中，然后依次加入：
[0051] 5XFirst-StrandBuffer 4 μ1
[0052] 0. 1ΜDTT 2 μ1
[0053]RNaseOUT(Invitrogen) 1 μ1
[0054] 3)輕輕混勻，37°C反應2min;
[0055] 4)加入 1μ1M-MLVRT，混勻，37°C反應 60min;
[0056] 5) 7(TC溫育 15min使M-MLVRT失活；
[0057]6)加入 1μ1RNaseH(Invitrogen)，37°C反應 20min;
[0058] 7)用超純水稀釋至合適濃度。作為PCR模板。
[0059] 1. 3TaHD2C全長克隆
[0060] 采用嵌套PCR技術進行兩輪PCR擴增，將擴增片段拼接得到一條全長為1310bp的 cDNA(核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示），該基因的開放閱讀框為933bp。
[0061] 1)引物序列：
[0062]正向引物為：TaHD-XbaGF：CTTTCTAGAATGGAGTTCTGGGGCCTTGAGG
[0063]反向引物為：TaHD-BamGR：CTTGGATCCCTTGGCCTCATGCTTGGCC
[0064] 2)PCR反應體系（20μ1):
[0065]
[0066] 3)PCR反應程序為：95°C3min;94°C40s，55°C40s，72°C40s，共 35 個循環(huán)；最后 72°C延伸lOmin。
[0067] 4)擴增片段的回收后與T載體連接、轉化大腸桿菌、選取陽性克隆測序。
[0068]確定小麥組蛋白去乙?；富騎aHD2CcDNA的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0069] 實施例2TaHD2C瞬時表達模式分析
[0070] 1)瞬時表達載體的構建
[0071] 利用傳統(tǒng)酶切連接的方法，用XbaI和BamHI雙酶切中間載體獲得HD2C全長序 列，連接于s326-GFP(Amp+)載體上，得到35S: :TaHD2C: :GFP瞬時表達載體。將購買的新鮮 洋蔥放入水中培養(yǎng)過夜，用刀和鑷子取2cmX2cm的內表皮，向下平鋪在1/2MS固體培養(yǎng)基 上，盡量放到皿中間，方便基因槍轟擊。用基因槍法轉化洋蔥表皮細胞，23°C靜置過夜培養(yǎng) (避光保存）。
[0072] 2)激光共聚焦觀察分析
[0073] 利用激光共聚焦488nm波長下顯微鏡觀察原生質體的GFP信號分布。
[0074] 結果表明，TaHD2C主要在細胞核內表達。
[0075] 實施例3TaHD2C的轉基因應用
[0076] 1.pSTART_TaHD2C植物表達載體的構建
[0077] 將測序正確的TaHD2C-pEASY-Blunt質粒，經(jīng)酶切、回收，與酶切后pSTART載體連 接，轉化大腸桿菌DH5α，在卡那抗性培養(yǎng)基上篩選陽性菌落，并對陽性菌落進行PCR及雙 酶切驗證。
[0078]2.獲得轉基因植株
[0079] 提取構建好的pSTART-TaHD2C質粒，轉化農(nóng)桿菌ΕΗΑ105,PCR檢測并擴大培養(yǎng)陽性 菌落，轉化Col-Ο野生型擬南芥。收取T1代種子，播種在含50μg/ml卡那抗性的MS培養(yǎng) 基上，培養(yǎng)十天左右觀察，陽性植株具抗性并長出綠色真葉，未成功轉化的陰性苗不長真葉 或真葉呈現(xiàn)黃色。將陽性苗移至營養(yǎng)土中兩周后，剪取少許葉片提取DNA，進行PCR測定。 鑒定出陽性苗后繼續(xù)篩選，直至獲得轉基因純合株系。
[0080] 3.轉基因植株分子鑒定
[0081] 對獲得的純合轉基因株系進行基因表達水平的檢測。提取轉基因植株和野生型 植株的總RNA，利用RT-PCR方法，分析過表達轉基因植株和野生型植株的TaHD2C基因表 達差異。篩選TaHD2C表達量明顯高于野生型植株的過表達轉基因株系進行開花相關通路 marker基因分析。
[0082] 4.TaHD2C基因的功能驗證
[0083] 1)轉基因過表達株系0E1和0E2的獲得及開花性狀分析。將表面消毒的過表達及 野生型和對照擬南芥種子鋪到1/2MS培養(yǎng)基上，4°C黑暗春化3天后放到溫室繼續(xù)培養(yǎng)。2 周后挑選大小長勢一致的幼苗移到土中，在長、短日照溫室培養(yǎng)，觀察他們的開花時間和抽 薹時的葉片數(shù)目。
[0084] 在長日照下，過表達系的抽薹時間為28-30天，野生型對照的抽薹時間約為24天 (圖1-A)。抽薹時過表達系的蓮座葉數(shù)目比野生型的蓮座葉數(shù)目多3片左右（圖1-B)。長 日照下，突變體的早花性狀及過表達的晚花性狀與短日照條件下表現(xiàn)一致。在短日照下，過 表達系的開花時間明顯晚于野生型對照（圖2)，以上結果說明小麥TaHD2C參與了擬南芥開 花抑制途徑，且對開花的抑制作用是不受光周期調控的。
[0085] 2)借助熒光實時定量Real-timePCR，進行開花相關各途徑響應基因的表達分析， 進一步確定TaHD2C基因在植物花期轉換中的作用。
[0086] 選取抽薹后的野生型和過表達系的地上部分，對與開花相關的四條途徑相關基因 分析，結果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉錄水平，自主及春化途徑相關的基因C0、CIB1、FKF1和GI的轉錄水平?jīng)]有明顯的上調或下調，PIF4的轉錄顯著下調（圖3B) ;CCA1、LHY和T0C1在過 表達系與野生型沒有顯著差異（圖3C)。開花途徑整合因子FT以及花分生組織特異基因FT mRNA轉錄水平下調極顯著（圖3A) ;AP1、LFY、S0C1基因表達量下調與WT呈顯著差異（圖 3A)。自主途徑相關基因如FPA、FY、FLD轉錄水平?jīng)]有明顯變化，PRP39轉錄顯著上調（圖 4D)。該結果與擬南芥過表達系晚花表型相一致。
[0087] GA受體GIDla轉錄水平顯著上調（圖5B)，DELLA蛋白中RGA、RGL1、RGL3表達量 顯著下調（圖5C)，表明TaHD2C過表達增強了GA信號。那GA的合成水平是否發(fā)生了變化 呢，對GA合成途徑的相關酶的轉錄水平進行了分析，發(fā)現(xiàn)GA合成途徑中GA3oxl顯著上調， 而將活性GA代謝為非活性GA的GA20oxl顯著下調（圖5A)，表明可能TaHD2C過表達后活 性GA合成水平上升。
[0088] 以上實驗證實，HD2C為一個開花抑制因子，在植物的花期轉換中起負調控作用。 Real-timePCR結果表明，HD2C通過參與光周期開花途徑中的開花途徑整合因子FT基因的 調控表達，進而影響花分生組織的基因表達，抑制植物開花。GA通過抑制花芽分化間接影響 過表達系產(chǎn)量。本研究亦發(fā)現(xiàn)，TaHD2C基因與擬南芥的花枝數(shù)目及產(chǎn)量密切相關。本發(fā)明 所述的小麥組蛋白去乙?；富騎aHD2C及其應用有望通過該基因的RNA干擾，縮短植物 營養(yǎng)生長的時間，提高植株花枝數(shù)目，為加快育種及提高作物產(chǎn)量提供幫助和支持。
【主權項】
1. 一種小麥組蛋白去乙?；富騎aHD2C，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列 如SEQIDNo. 1所示；所述基因cDNA編碼的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。2. 權利要求1所述小麥組蛋白去乙?；富騎aHD2C在調控植物過表達系花期轉換 中的應用。3. 權利要求1所述小麥組蛋白去乙?；富騎aHD2C在通過花枝數(shù)目的調控實現(xiàn)影 響轉基因植物產(chǎn)量中的應用。4. 如權利要求2或3所述的應用，其特征在于：所述植物是擬南芥或普通小麥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥組蛋白去乙?；富騎aHD2C，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示；所述基因cDNA編碼的氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示。本發(fā)明還公開了所述基因TaHD2C在擬南芥過表達系花期轉換及產(chǎn)量調控中的應用；實驗證明，TaHD2C基因可使擬南芥過表達系開花延遲，且不受光周期影響；與野生型相比，過表達系花期株型的花枝數(shù)目明顯減少，產(chǎn)量降低。預示本發(fā)明所述基因有望在縮短農(nóng)作物育種年限及產(chǎn)量提升上提供幫助和支持，進一步為作物品質改良和新品種的選育奠定理論基礎。
【IPC分類】C12N9/78, C12N15/55, A01H5/00
【公開號】CN105274126
【申請?zhí)枴緾N201510851529
【發(fā)明人】王敏琴, 齊魯琦, 徐嬌, 張少華, 夏光敏
【申請人】山東大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月26日