一種檢測線粒體dna a1555g突變的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體的本發(fā)明提供了一種檢測線粒體DNAA1555G突變的試劑盒，此外本發(fā)明還提供了該試劑盒在預(yù)測美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]美尼爾氏病，又稱眩暈癥、內(nèi)耳眩暈癥、膜迷路積水，是一種常見病、多發(fā)病。本病癥狀的出現(xiàn)是由內(nèi)耳膜迷路內(nèi)積水膨脹，壓迫內(nèi)耳終器所致。有如下4個癥狀:眩暈、耳聾、耳鳴及耳內(nèi)悶脹感。其中眩暈多為突然發(fā)作的旋轉(zhuǎn)性眩暈?；颊叱８兄車矬w圍繞自身沿一定的方向旋轉(zhuǎn)，閉目時癥狀可減輕。常伴惡心、嘔吐、面色蒼白、出冷汗、血壓下降等自主神經(jīng)反射癥狀。頭部的任何運動都可以使眩暈加重?；颊咭庾R始終清楚，個別患者即使突然摔倒，也保持著清醒狀態(tài)。眩暈持續(xù)時間多為數(shù)10分鐘或數(shù)小時，最長者不超過24小時。眩暈發(fā)作后可轉(zhuǎn)入間歇期，癥狀消失，間歇期長短因人而異，數(shù)日到數(shù)年不等。眩暈可反復(fù)發(fā)作，同一患者每次發(fā)作的持續(xù)時間和嚴(yán)重程度不盡相同，不同患者之間亦不相同。且眩暈發(fā)作次數(shù)越多，每次發(fā)作持續(xù)時間越長，間歇期越短。
[0003]據(jù)報道，約20%的美尼爾氏病患者有家族史，該疾病很可能是一種基因與環(huán)境共同作用所致的疾病，目前已研究的致病基因主要包括凝血因子C同源物基因(C0CH)、人白細(xì)胞抗原基因(HLA)、水通道蛋白基因(AQP)和鉀離子通道基因(KCNE)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明人通過分析大量臨床樣本，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA A1555G突變與美尼爾氏病顯著相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)提供了一種預(yù)測美尼爾氏病發(fā)病可能性的新方法，為美尼爾氏病的早期診斷、預(yù)防提供了新的思路。
[0005]—方面，本發(fā)明提供了一種檢測線粒體DNA A1555G突變的試劑盒，其包含一對引物:
弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，
引物 2:tgggattttttaggtagtgg0
[0006]另一方面，本發(fā)明提供了該試劑盒在在預(yù)測美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。
[0007]進一步的方法，應(yīng)用包括使用試劑盒中的引物擴增待測對象基因組DNA樣品后電泳檢測，如果得到702bp片段，則表明樣品主體有A1555G突變，進而有較高的美尼爾氏病發(fā)病可能性。
[0008]再另一個方面，本發(fā)明提供了引物對在制備預(yù)測美尼爾氏病發(fā)病可能性的試劑盒中的應(yīng)用，其中引物對序列為:
弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，
引物 2:tgggattttttaggtagtgg0
[0009]
【具體實施方式】
[0010]1引物設(shè)計與合成
使用引物設(shè)計軟件Primer Premier 6.0，根據(jù)Genbank中的人線粒體DNA序列設(shè)計檢測A1555G突變的引物對:
弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，
引物 2:tgggattttttaggtagtgg0
[0011]設(shè)計的引物對由上海英駿公司合成。
[0012]2具體檢測過程樣品處理:
取這待測者的血濾紙片，將血濾紙片剪碎紙片放入1.5ml Eppendorf管，加入900 μ 1紅細(xì)胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl, pH 7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀；在裝有白細(xì)胞沉淀的1.5mlEP管中加入600 μ 1的細(xì)胞裂解液(10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA、0.1% SDS，pH 8.0)和3“1 的蛋白酶溶液(20mg/ml蛋白酶K)，充分混勻，55°C恒溫消化裂解2?3h ;待消化液降至室溫，加入200 μ 1預(yù)冷5mol/L醋酸鉀溶液，充分混勻，12000rpm_4°C離心15min ;取約700 μ 1上清加入600 μ 1異丙醇于一新的1.5ml Eppendorf管中，充分混勾，-20°C冰浴30min后，12000rpm離心lOmin收集DNA沉淀；加入600 μ 1乙醇洗滌DNA沉淀，12000rpm離心5min，棄上清，待乙醇揮發(fā)干燥后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013]PCR 過程:
PCR 反應(yīng)體系為 lOxPCR 緩沖液 4μ UdNTP (2.5mM) 2.5 μ UMgCl2 (25mM) 2.5 μ 1、引物 1 (5μΜ) 0.5μ1、引物 2 (5 4]\00.5“1、丁&1酶(51]/^1) 0.5 μ 1、模板 DNA 50ng、雙蒸水補充至25 μ 1。
[0014]PCR反應(yīng)過程為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)7次；94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，重復(fù)循環(huán)30次；72°C延伸5min。
[0015]電泳方法為PCR產(chǎn)物10 μ 1在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)ΕΒ染色后在紫外線檢測儀上觀察并照相記錄結(jié)果。
[0016]結(jié)果判讀方法為如果得到702bp片段，則表明樣品主體有A1555G突變；如果未發(fā)現(xiàn)702bp片段，則表明樣品主體沒有A1555G突變。
[0017]3引物特異性驗證
選取下面第4部分中的陰性樣本(無A1555G突變)10例，陽性樣本6例(有A1555G突變)進行了線粒體DNA 12S rRNA直接測序分析，結(jié)果與使用本發(fā)明引物PCR檢測結(jié)果完全相同，證明了本發(fā)明的引物對具備良好的特異性和準(zhǔn)確性。
[0018]4美尼爾氏病與A1555G突變的關(guān)聯(lián)分析
選取臨床中發(fā)現(xiàn)的一個中國北方美尼爾氏病家系中的9位患者(分布在2代中)和4位非患者，以及100名無血緣關(guān)系的正常對照，按照【具體實施方式】第2部分的方法進行檢測。
[0019]家系中所有9位患者里均發(fā)現(xiàn)了 A1555G突變；家系中4位非患者里均無A1555G突變；100名無血緣關(guān)系的正常對照中1位有A1555G突變，99位無A1555G突變。
[0020]結(jié)果初步表明了 A1555G突變與美尼爾氏病之間存在一定關(guān)聯(lián)性。
【主權(quán)項】
1.一種檢測線粒體DNA C1494T突變的試劑盒，其包含一對引物:弓I 物 1:acgcattaatttagagaagg，引物 2:tgggattttttaggtagtgg02.權(quán)利要求1的試劑盒在預(yù)測美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，該應(yīng)用包括使用試劑盒中的引物擴增待測對象基因組DNA樣品后電泳檢測，如果得到702bp片段，則表明樣品主體有C1494T突變，進而有較高的美尼爾氏病發(fā)病可能性。4.引物對在制備預(yù)測美尼爾氏病發(fā)病可能性的試劑盒中的應(yīng)用，其中引物對序列為:引物 1:tacgaaagtggctttaacata，引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測線粒體DNA？A1555G突變的試劑盒，其包含一對引物，引物1：acgcattaatttagagaagg，引物2：tgggattttttaggtagtgg。此外，本發(fā)明還提供了該試劑盒在預(yù)測美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105296607
【申請?zhí)枴緾N201510473347
【發(fā)明人】于剛, 菅慧蓉, 陳剛, 李赟, 張?zhí)礻? 代小燕, 王國濤
【申請人】于剛
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年8月5日