一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在蛋白質(zhì)酶解方面存在著蛋白質(zhì)酶解敏感性低、蛋白水解不徹底等的瓶頸 及核心問題，嚴(yán)重制約了酶解技術(shù)在蛋白質(zhì)加工中的應(yīng)用。為了提高蛋白質(zhì)的酶解效果，通 常在酶解前進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖冃蕴幚恚ㄈ鐭嶙冃蕴幚恚?，通過改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使之更易 于與酶結(jié)合，從而改善酶解特性。但是，劇烈的處理方式會(huì)影響酶解產(chǎn)物功能活性肽的生物 活性及儲藏特性，而超高壓技術(shù)作為近二十幾年來新興的一項(xiàng)食品非熱加工技術(shù)，其特點(diǎn) 是在保持制品營養(yǎng)成分和風(fēng)味的前提下，延長制品的貯藏期、提高安全性、改善組織結(jié)構(gòu)， 尤其在改變蛋白質(zhì)特性、調(diào)節(jié)酶活力方面有著突出的優(yōu)勢，是一種有效的處理手段。部分學(xué) 者已對其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，如Heremans K和Belloque J等研究發(fā)現(xiàn)，高壓處理可通過影 響蛋白質(zhì)三級、四級結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵氫鍵、離子鍵和疏水鍵等，使蛋白類酶的結(jié)構(gòu)伸展而變 得松散，從而暴露出更多結(jié)合位點(diǎn)，易于酶解反應(yīng)的進(jìn)行；Morild E.等研究表明，較低壓力 (< 200MPa壓力下，保壓10~20min)處理可使蛋白類酶活性中心發(fā)生凝聚作用，其原因可 能是壓力改變了形成酶活性中心基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，使得完整組織中經(jīng)常被隔離的酶 和基質(zhì)相接觸，從而加速酶促反應(yīng)。
[0003] 然而，目前國內(nèi)外學(xué)者在高壓處理對酶解反應(yīng)影響的研究大多集中在蛋白質(zhì)方 面，而在高壓處理對酶活性影響機(jī)理方面的研究報(bào)道較少。有鑒于此，本發(fā)明以胃蛋白酶為 高壓處理對象，用高壓處理后的胃蛋白酶水解酪蛋白，測定了高壓處理后的胃蛋白酶酶活 力及其水解酪蛋白產(chǎn)物的水解度，研究了高壓處理對胃蛋白酶酶解特性的影響，以期為進(jìn) 一步探索超高壓促進(jìn)胃蛋白酶酶解的機(jī)理打下基礎(chǔ)。
[0004] 目前還沒有高壓處理提高胃蛋白酶活力方法的專利公開，人們希望發(fā)明出高壓處 理提高胃蛋白酶活力的方法，實(shí)現(xiàn)提高胃蛋白酶活力的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，包括以下步驟：
[0006] 第一步酶溶液的制備稱取定量胃蛋白酶溶于pH 1.5的鹽酸溶液，使?jié)舛冗_(dá)到 2mg/mL，4°C冷藏，lh內(nèi)迅速完成高壓處理。
[0007] 第二步高壓處理將制備的酶溶液經(jīng)真空包裝，隨后置于高壓處理設(shè)備中，于 20°C下，進(jìn)行l(wèi)OOMPa壓力下保壓10-20min的處理。
[0008] 第三步保存將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0009] 通過本發(fā)明的一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，使胃蛋白酶活力提高了 29 %以上，胃蛋白酶活力顯著提高，實(shí)現(xiàn)了提高胃蛋白酶活力的目的。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明不同壓力對胃蛋白酶酶活力及酶解產(chǎn)物水解度影響圖；
[0011] 圖2是本發(fā)明不同保壓時(shí)間對胃蛋白酶酶活力及酶解產(chǎn)物水解度影響圖；
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1 :
[0013] 第一步酶溶液的制備稱取10g胃蛋白酶溶于pH 1.5的鹽酸溶液，使?jié)舛冗_(dá)到 2mg/mL，總體積為5升的胃蛋白酶溶液，在4°C下冷藏。
[0014] 第二步將制備好的胃蛋白酶溶液立即真空包裝，然后置于高壓處理設(shè)備中，于 20°C下，進(jìn)行l(wèi)OOMPa壓力下保壓15min的處理。
[0015] 第三步將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0016] 實(shí)施例2:
[0017] 第一步酶溶液的制備稱取2g胃蛋白酶溶于pH 1. 5的鹽酸溶液，使?jié)舛冗_(dá)到 2mg/mL，總體積為1升的胃蛋白酶溶液，在4°C下冷藏。
[0018] 第二步將制備好的胃蛋白酶溶液立即真空包裝，然后置于高壓處理設(shè)備中，于 20°C下，進(jìn)行l(wèi)OOMPa壓力下保壓20min的處理。
[0019] 第三步將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0020] 以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例，顯然本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有 其他變形。
[0021] 下面結(jié)合科學(xué)實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明的效果進(jìn)一步說明。
[0022] 1試驗(yàn)材料與設(shè)備
[0023] 1. 1胃蛋白酶：上海晶純生化科技股份有限公司，酶活力1 : 15000 ;酪蛋白：北京 索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白：北京賽為思生物技術(shù)開發(fā)中心；L-酪氨酸：北京奧博 星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。主要試劑：甲醛，三（羥甲基）氨基甲烷，乙二胺四乙酸二鈉，甘 氨酸，尿素，5, 5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸，三氯乙酸，1-苯胺基-8-萘磺酸，鐵氰化鉀，三氯 化鐵，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，無水乙醇，鄰苯三酚，鄰二氮菲，硫酸亞鐵，雙氧水等，實(shí) 驗(yàn)中所用其他化學(xué)試劑均為分析純。
[0024] 1. 2試驗(yàn)設(shè)備
[0025] UHPF_750MPa型超高壓處理裝置：包頭科發(fā)新型高科技食品機(jī)械有限公司，工 作壓力600MPa，功率5KW);多功能真空包裝機(jī)：山東省諸城市中鼎機(jī)械；SHA-C數(shù)顯水浴 恒溫振蕩器：江蘇省金壇市華峰儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠； KjelteCTM8400全自動(dòng)凱氏定氮儀：丹麥福斯FOSS Denmark ;TU-1810型紫外分光光度 計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Cary Fluorescence焚光分光光度計(jì)：美國安捷 倫Agilent ;MULTIFUGE XIR型冷凍離心機(jī)：德國Thermo ;ALPHA1-2LD型冷凍干燥機(jī)：德 國Christ German ;Model 270凝膠色譜儀：英國Malvern ;高效液相色譜儀：美國Waters 600 ;電泳儀：美國Bio-RAD。
[0026] 2試驗(yàn)方法
[0027] 2. 1酶溶液：在測定前，稱取定量胃蛋白酶溶于pH 1. 5的鹽酸溶液，使?jié)舛冗_(dá)到 2mg/mL，4°C冷藏，lh內(nèi)迅速完成高壓處理。
[0028] 2. 2超高壓處理
[0029] 將制備的酶溶液經(jīng)真空包裝（vacuum-packed)，隨后置于高壓處理設(shè)備中，于 20°(：下，進(jìn)行50、100、150、20010^壓力下保壓2〇11^11的處理，確定最佳壓力；
[0030] 在最佳壓力下進(jìn)行5、10、15、20min保壓處理，確定最佳高壓處理時(shí)間；
[0031] 以未經(jīng)高壓處理（常壓0.1 MPa)的樣液作為對照。
[0032] 2. 3酶解反應(yīng)
[0033] 高壓處理后的酶溶液中加定量酪蛋白，使酪蛋白濃度達(dá)到10mg/mL，酶濃度 1. 75mg/mL，調(diào)pHl. 5、于57°C恒溫水浴振蕩器中酶解4h。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶lOmin，冷 卻至室溫，4°C冷藏，測定各指標(biāo)。
[0034] 3.測定指標(biāo)
[0035] 3.1胃蛋白酶活力測定
[0036] 依據(jù)SB/T 10317-1999,采用福林酚法（folin-phenol method)測定胃蛋白酶酶 活力。酶活力單位的定義：在50°C條件下，lmin水解1克酪蛋白產(chǎn)生1 μ g酪氨酸定義為1 個(gè)酶活力單位（U)。
[0037] 3. 2酶解液水解度的測定
[0038] 采用甲醛滴定法，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混勻后取20mL置 于200mL燒杯中，加入60mL去0)2水，用0. 05mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至pH 8. 2。加入 10mL甲醛溶液，混勻后再用0. 05mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH 9. 2,同時(shí)用蒸餾水代 替酶解液做空白對照。記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，計(jì)算水解度（DH)。
[0040] 式中，c為標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度，mol/L A為樣品消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體 積，mL ;V2為試劑空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL ;V3為試劑稀釋液取用量，為 lmL(5mL酶解液定容100mL后取用20mL) ;S為底物濃度；W為樣品中蛋白質(zhì)含量，本實(shí)驗(yàn)所 用酷蛋白樣品中蛋白質(zhì)含量為87. 34% ;htot為蛋白質(zhì)中妝鍵總數(shù)mmol/g，酷蛋白中妝鍵 總數(shù)為 8. 2 X 10 3mmol/g。
[0041] 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0042] 4. 1不同壓力對酶活力及酶解產(chǎn)物水解度的影響
[0043] 不同壓力處理的胃蛋白酶活力及對應(yīng)處理組（圖1中壓力為OMPa)酶解酪蛋白的 水解度變化情況見圖1。由圖可知，與未加壓處理樣品相比，lOOMPa的壓力處理可顯著增 強(qiáng)胃蛋白酶活力（P < 〇. 05)，使水解酪蛋白所得產(chǎn)物的水解度顯著提高（p < 0. 05)，且在 lOOMPa時(shí)酶活力及水解度達(dá)到最高，酶活力及水解度分別從空白樣的16. 5X 104u、8. 23% 提高到21. 86X 104u、11. 25%，分別提高了 32. 48%和36. 70%，之后隨壓力增加迅速下降；
[0044] 4. 2不同保壓時(shí)間對酶活力及酶解產(chǎn)物水解度的影響
[0045] 不同保壓時(shí)間處理的胃蛋白酶活力及對應(yīng)處理組（圖2中保壓時(shí)間為Omin)酶解 酪蛋白的水解度變化情況見圖2。在lOOMPa壓力下，隨保壓時(shí)間的延長，胃蛋白酶活力及 酶解物的水解度均顯著提高（P < 〇. 05)。故lOOMPa，10-20min的壓力處理可顯著改善胃 蛋白酶活力及該酶水解酪蛋白的能力。在保壓15min時(shí)，酶活力及水解度分別從空白樣的 12. 52X 104u、8. 23%提高到 21. 36X 104u、ll. 02%，分別提高了 29. 45%和 33. 90%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.本發(fā)明一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，其特征在于： (1) 酶溶液的制備：稱取定量胃蛋白酶溶于pHl. 5的鹽酸溶液，使?jié)舛冗_(dá)到2mg/mL，4°C 冷藏，lh內(nèi)迅速完成高壓處理。 (2) 高壓處理：將制備的酶溶液經(jīng)真空包裝，隨后置于高壓處理設(shè)備中，于20°C下，進(jìn) 行l(wèi)OOMPa壓力下保壓10-20min的處理。 (3) 保存：將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
【專利摘要】本發(fā)明一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法。稱取定量胃蛋白酶溶于pH？1.5的鹽酸溶液，使?jié)舛冗_(dá)到2mg/mL，4℃冷藏，1h內(nèi)迅速完成高壓處理。將制備的酶溶液經(jīng)真空包裝，隨后置于高壓處理設(shè)備中，于20℃下，進(jìn)行100MPa壓力下保壓10-20min的處理。將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1℃下冷藏保存。通過本發(fā)明的一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，使胃蛋白酶活力提高了29％以上，胃蛋白酶活力顯著提高，實(shí)現(xiàn)提高胃蛋白酶活力的目的。
【IPC分類】C12N9/48
【公開號】CN105316305
【申請?zhí)枴緾N201510827332
【發(fā)明人】馬漢軍, 劉本國, 康壯麗, 李斌, 白騰輝
【申請人】河南科技學(xué)院
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年11月17日