熒光檢測(cè)試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、考馬斯亮藍(lán)R250購(gòu)于碧云天 生物技術(shù)研究所?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人HSP70單克隆抗 體、兔抗人ICAM-1單克隆抗體、兔抗人G250多克隆抗體購(gòu)于Sigma公司。兔抗人Survivin 多克隆抗體武漢博士德生物有限公司。
[0030] 超凈工作臺(tái)（蘇州華新空調(diào)凈化有限公司），自動(dòng)平衡離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器 廠(chǎng)），光學(xué)顯微鏡（NIKON，日本），透射電子顯微鏡（LeicaTCS-NT，德國(guó)），低溫高速離心機(jī) (日立公司，日本），低溫超高速離心機(jī)H-80B(日立公司，日本）。垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)槽（北 京六一廠(chǎng)，中國(guó)）。臺(tái)式高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)，中國(guó)）。96孔培養(yǎng)板 (Corning公司，美國(guó)）。凝膠儀、PCR擴(kuò)增儀（BI0-RAD，美國(guó)）。
[0031] 二、試驗(yàn)方法
[0032] 1、MTT檢測(cè)化合物（I)不同濃度48h對(duì)腎癌細(xì)胞株RC-2增殖的影響
[0033] 用含10%小牛血清的1^1-1640培養(yǎng)液（含有0.1%青霉素、鏈霉素）常規(guī)培養(yǎng) 人腎癌細(xì)胞株RC-2,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度1~2天換液一次，3天傳代一次。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì) 胞，按照如下步驟操作：（1)接種細(xì)胞：胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌RC-2細(xì)胞，用含10%小 牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液lmL制成單細(xì)胞懸液，混勻后用移液管按照體積100μL/孔，即 接種腎癌細(xì)胞數(shù)目5X103個(gè)/孔，加入96孔培養(yǎng)板中。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；（2)培養(yǎng)細(xì) 胞：將培養(yǎng)板小心置入孵箱中（37°C、5%C02)培養(yǎng)3天；(3)處理細(xì)胞：分別按空白組（加 5yLDMS0液）、0· 25、0· 5、0· 75、1ymol/L化合物（I)處理組分組后加藥處理48h;(4)顯 色：在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，予以每孔各加入MTT溶液20μL，之后繼續(xù)放入孵箱中孵育4h，然后小心 把孔內(nèi)培養(yǎng)液用注射器吸去；對(duì)于當(dāng)天接種的細(xì)胞而言，離心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后 將孔內(nèi)培養(yǎng)液移除。之后把150μLDMS0加入每孔，使其充分振蕩10min后，把結(jié)晶物溶解 完全；（5)比色：在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在580nm波長(zhǎng)下的光密度值[(D580)]，按公式 測(cè)定細(xì)胞活力：D(580)實(shí)驗(yàn)孔/D(580)對(duì)照孔X100%。
[0034] 2、MTT檢測(cè)0· 5μΜ化合物（I)不同時(shí)間對(duì)腎癌細(xì)胞株RC-2增殖的影響
[0035] 接種和處理細(xì)胞及顯色和比色步驟同上（1)、（2)、（4)、（5)，處理細(xì)胞：分別按空 白組（加5μLDMS0液）、0· 5μΜ化合物（I)處理24h、48h、72h分組。
[0036] 3、制備exosomes
[0037] (1)細(xì)胞分組：取6份細(xì)胞計(jì)數(shù)相近的人腎癌RC-2細(xì)胞株體外常規(guī)培養(yǎng)，其中 三份為對(duì)照組（CE)，另外三份為實(shí)驗(yàn)組（CE2)，等細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，兩組細(xì)胞株按照 3X106/100mL重新傳代至新的培養(yǎng)瓶，嚴(yán)格控制每組細(xì)胞培養(yǎng)基的體積一致；在實(shí)驗(yàn)組，等 細(xì)胞培養(yǎng)48h后加入0. 5μΜ的化合物（I)處理細(xì)胞48h，之后收集培養(yǎng)上清液各150mL; 對(duì)照組不加藥物，加入與實(shí)驗(yàn)組等量的DMSO, 48h后收集培養(yǎng)上清液各150mL，置于-20°C冰 箱保存；（2)提取exosomes:培養(yǎng)上清液150mL，300g低溫離心（4°C)lOmin去除細(xì)胞；800g 低溫離心30min獲取上清10000g低溫離心30min獲取上清通過(guò)100kDMffCOCentriplus 離心超濾管濃縮超濾（MffCO:分子量截留），以1000g離心30min，得到約20mL超濾液。將超 濾液分別移至2mL含30g/L的蔗糖重水墊的10mL的離心管中，100000g低溫超速離心lh。 收集離心管底部的緩沖墊用PBS稀釋?zhuān)糜?00kDMffCO高回收率高流速切向流超濾離心管 中1000g離心30min，得到3mLexosome。0· 22μπι濾膜過(guò)濾除菌，_80°C保存?zhèn)溆迷O(shè)置對(duì)照 組細(xì)胞（CE1)來(lái)源的exosomes為EX1組exosomes，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（CE2)來(lái)源的exosomes為 EX2 組exosomes〇
[0038] 4、BCA法檢測(cè)exosomes蛋白含量
[0039] ⑴測(cè)定方法：取96孔酶標(biāo)板，按下表加入試劑并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：
[0041] 上述試劑加完后，準(zhǔn)確吸取10μL樣品溶液于酶標(biāo)孔中，加入BCA試劑200μL，輕 搖，于37°C保溫30min，冷卻至室溫后，以空白為對(duì)照，在酶標(biāo)儀上562nm處比色，以牛血清 白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)空白為對(duì)照，根據(jù)樣 品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出樣品的蛋白質(zhì)濃度；（2)計(jì)算方法：exosome濃縮液總蛋白質(zhì) 含量（mg)=濃縮后的總體積XBCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，取平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析。
[0042] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0043] 使用軟件GRAGHPADPRISM5.0進(jìn)行圖表制作及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以1±8表 示，比較組間差異使用方差分析或t檢驗(yàn)。
[0044] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0045] 1、MTT顯示不同濃度化合物（I)作用腎癌細(xì)胞株RC-2后細(xì)胞活力變化
[0046] MTT結(jié)果顯示當(dāng)化合物（I)濃度0· 75μΜ作用細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活力 (71. 32±4· 68 % )與化合物（I)濃度0· 5μΜ及0· 25μΜ作用細(xì)胞時(shí)細(xì)胞組 (91. 43±2. 74% ;94. 67±1. 21% )相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ〈0. 05)。
[0047] 2、ΜΤΤ顯示0· 5μΜ化合物（I)不同時(shí)間作用腎癌細(xì)胞株RC-2后細(xì)胞活力變化
[0048] ΜΤΤ結(jié)果顯示當(dāng)0·5μΜ化合物（I)作用細(xì)胞72h組（71·34±1·64% )與作用 48h組（91·04±6·23% )、24h組（94·56±1· 13% )對(duì)比，細(xì)胞活力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (Ρ〈0· 05) 〇
[0049] 3、Exosomes計(jì)數(shù)和蛋白定量
[0050] 電鏡下實(shí)驗(yàn)組（EX2)和對(duì)照組（EX1)exosomes計(jì)數(shù)和exosomes蛋白定量結(jié)果：經(jīng) 化合物（I)處理后，RC-2細(xì)胞產(chǎn)生的exosomes數(shù)量和exosome蛋白含量較未經(jīng)藥物處 理組都明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈〇. 05)。結(jié)果見(jiàn)表1。
[0051] 結(jié)果說(shuō)明，化合物（I)能夠抑制腎癌細(xì)胞株RC-2增殖，這種抑制呈濃度及時(shí)間 依賴(lài)性。經(jīng)化合物（I)處理后，透射電鏡觀(guān)察腎癌細(xì)胞株RC-12源性exosomes形態(tài)未見(jiàn) 明顯改變，其分泌量和蛋白含量較處理前明顯增加（P<〇. 05)，這些說(shuō)明化合物（I)對(duì)腎 癌細(xì)胞株RC-12的抑制作用與化合物（I)引起的腎癌細(xì)胞RC-2表達(dá)野生型p53mRNA上 調(diào)有關(guān)。
[0052] 表1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分泌exosomes數(shù)量及蛋白含量對(duì)比
[0053]
[0054] 實(shí)施例3
[0055] 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0056] 實(shí)施例4
[0057] 口服液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制 成口服液。
[0058] 實(shí)施例5
[0059] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0060] 實(shí)施例6
[0061] 注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0062] 實(shí)施例7
[0063] 無(wú)菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無(wú)菌注射 用水中，攪拌使溶，用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌 熔封得粉針劑。
[0064] 上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I )，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a) 將干燥貓爪草粉碎，用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫10個(gè)柱體積， 再用75 %乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏； (c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、40:1、20:1、10:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一 步分離，依次用體積比為25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e) 步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水 溶液等度洗脫，收集9~13個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I )。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述大孔樹(shù)脂為AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為75 %。5. -種藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I )和藥學(xué)上 可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I )在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新的二萜類(lèi)化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途，屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及從干燥貓爪草中分離得到的一種新的二萜類(lèi)化合物、制備方法和該化合物的醫(yī)藥用途。該化合物為首次報(bào)道，可以從干燥貓爪草中提取、分離純化得到，純度高。體外試驗(yàn)證明該化合物能夠抑制腎癌細(xì)胞株RC-2增殖，這種抑制呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性，可以進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)成治療腎癌的藥物。
【IPC分類(lèi)】C07C67/48, C07C69/72, A61K31/22, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105330546
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510887927
【發(fā)明人】楊輝
【申請(qǐng)人】西寧意格知識(shí)產(chǎn)權(quán)咨詢(xún)服務(wù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日