一種快速檢測(cè)灰飛虱離子型γ-氨基丁酸受體基因突變的方法
【專利說明】-種快速檢測(cè)灰飛動(dòng)離子型γ-氨基Τ酸受體基因突變的 方法 -、技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明基于昆蟲的離子型丫-氨基下酸受體是苯基化挫類殺蟲劑（包括氣蟲臘和 乙蟲臘等）的作用祀標(biāo)，設(shè)及一種快速準(zhǔn)確鑒定灰飛風(fēng)對(duì)此類型殺蟲劑祀標(biāo)突變的方法。 二、技術(shù)背景
[0002] 灰飛風(fēng)Laodel地axstriatellus(Fall6n)是水稻的重要害蟲之一，其不僅刺吸 取食水稻、小麥、玉米及高梁等多種作物，更重要的是傳播水稻條紋葉枯病毒巧iceStripe Virus,RSV)、水稻黑條矮縮病毒巧iceBlackStreakedDwarfVirus,RBSDV)、小麥叢矮病 毒（WheatRosetteSl:untVi;rus，WRSV)及玉米粗縮病（MaizeRou曲DwarfVirus,Μ畑V) 等病害，并且傳毒造成的危害遠(yuǎn)大于直接刺吸危害。由于至今沒有理想的防治病毒病的藥 劑，治蟲防病成為挽回?fù)p失的主要手段（班蘭風(fēng)等，2015)。
[0003] 昆蟲離子型丫 -氨基下酸受體（GABArec巧tor)主要介導(dǎo)神經(jīng)和肌肉細(xì)胞中快速 的抑制性突觸傳遞，研究表明其畑L亞基（resistancetodiel化in,抗狄氏劑）是環(huán)戊二 締類和苯基化挫類殺蟲劑的分子祀標(biāo)，但目前至少有19種昆蟲已報(bào)道產(chǎn)生了抗性突變，其 中灰飛風(fēng)的RDL亞基第283位氨基酸也產(chǎn)生了與氣蟲臘抗性有關(guān)的A2'N突變，電生理試驗(yàn) 表明突變的受體會(huì)對(duì)降低對(duì)藥劑的敏感性（化kaoetal.，2011)。目前關(guān)于灰飛風(fēng)抗藥性 的監(jiān)測(cè)大都局限于室內(nèi)藥劑毒力生物測(cè)定，尚未見到相關(guān)快速檢測(cè)的報(bào)道，然而生測(cè)結(jié)果 并不能對(duì)祀標(biāo)抗性產(chǎn)生精準(zhǔn)判斷，并且存在實(shí)驗(yàn)周期長，蟲量需求大等卻缺點(diǎn)，因此在生產(chǎn) 實(shí)踐中需要一種能夠快速檢測(cè)灰飛風(fēng)抗性突變的方法。
[0004] 氣蟲臘、乙蟲臘和下締氣蟲臘同屬于苯基化挫類殺蟲劑，對(duì)刺吸式和巧嚼式口器 害蟲具有較高的殺蟲活性。1994年，氣蟲臘在我國獲得首個(gè)登記并開始用于水稻、蔬菜害蟲 的防治，但由于長期不合理使用，一些重要農(nóng)業(yè)害蟲（如小菜蛾、煙粉風(fēng)、斜紋夜蛾W及二 化懼等）已報(bào)道對(duì)氣蟲臘產(chǎn)生了抗藥性，再加之氣蟲臘會(huì)對(duì)農(nóng)作物周圍的蜜蜂、蝴蝶、蠕艇 等造成影響，因此氣蟲臘于2009年在我國被限制使用，目前只允許作為衛(wèi)生用藥等部分旱 田作物種子包衣劑登記。然而乙蟲臘和下締氣蟲臘仍可用于水稻害蟲能防治，并已有報(bào)道 證明了田間品系的灰飛風(fēng)種群產(chǎn)生了對(duì)乙蟲臘的A2'N的抗性突變巧Izakietal. ,2015)， 因此昆蟲對(duì)于苯基化挫類殺蟲劑還存在著一定抗性突變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。 陽0化]需要說明的是，雖然劉澤文等先前已申請(qǐng)公布了《褐飛風(fēng)對(duì)苯基化挫類殺蟲劑抗 藥性分子檢測(cè)方法》（專利號(hào)：201110003232. 9)的專利（劉澤文等，2013)，然而，褐飛風(fēng)與 灰飛風(fēng)雖為同科但歸為不同屬種，且兩者突變位點(diǎn)和檢測(cè)驗(yàn)證方法也有較大差異，鑒于灰 飛風(fēng)傳毒危害多種作物W及苯基化挫類殺蟲劑的抗性發(fā)展現(xiàn)狀等諸多因素，因此考慮申報(bào) 此項(xiàng)專利，W期為農(nóng)業(yè)害蟲綜合防治提供方法參考。 Ξ、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的為了克服目前室內(nèi)毒力生物測(cè)定方法靈敏度低、周期長、材料要求高等 現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)灰飛風(fēng)離子型GABA受體對(duì)苯基化 挫類殺蟲劑產(chǎn)生的抗性突變。
[0007] 技術(shù)方案W在室內(nèi)用氣蟲臘多年連續(xù)篩選的對(duì)苯基化挫類殺蟲劑具有高水平抗 性品系灰飛風(fēng)為試驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)過基因克隆手段已驗(yàn)證了其中大部分個(gè)體的RDL亞基基因已 產(chǎn)生了與氣蟲臘抗性有關(guān)的A2'N突變，因此根據(jù)灰飛風(fēng)RDL亞基的基因序列，在突變位點(diǎn) 處設(shè)計(jì)特異性引物，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果來判斷灰飛風(fēng)對(duì)苯基化挫類殺蟲劑的抗性水 平。
[0008] 有益效果本發(fā)明提供的特異性引物組合物能夠有效鑒定出灰飛風(fēng)離子型丫-氨 基下酸受體是否發(fā)生了A2'N突變，從而判斷灰飛風(fēng)對(duì)苯基化挫類殺蟲劑的抗性水平，具有 操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、周期短、需要材料少等優(yōu)點(diǎn)，與褐飛風(fēng)突變檢測(cè)相比（劉澤 文等，2013)，本方法設(shè)計(jì)引物少，操作更加簡便，且在PCR過程不易產(chǎn)生引物二聚體（影響 電泳觀察），同時(shí)，通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序來驗(yàn)證結(jié)果正確性的方式更加簡便準(zhǔn)確，因此 本專利對(duì)于監(jiān)測(cè)灰飛風(fēng)田間種群對(duì)苯基化挫類殺蟲劑的抗藥性發(fā)展動(dòng)態(tài)、指導(dǎo)合理用藥和 延緩抗性發(fā)展具有重要意義。
【附圖說明】
[0009] 圖1為W室內(nèi)抗性篩選和敏感純化的灰飛風(fēng)個(gè)體為模板，分別采用敏感引物對(duì)或 抗性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0010] 1~5泳道為敏感純合子（試蟲來自于敏感品系），6~10泳道為雜合子（試蟲來 自于抗性品系），11~15泳道為抗性純合子（試蟲來自于抗性品系），DNAMarker所示條 帶大小如圖。
[0011] 圖2為灰飛風(fēng)基因組畑L亞基基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的峰圖。 陽01引敏感/抗性純合子在突變位置GTC(GC/AA)C為單一峰圖，而雜合子為雙峰，運(yùn)與AS-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。 陽〇1引技術(shù)方案
[0014] W下所述的試驗(yàn)操作便于更好的理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述內(nèi)容中所用 試驗(yàn)材料與方法，如無特殊說明，均為常規(guī)材料和方法。
[0015] 1.等位基因特異性引物的設(shè)計(jì)
[0016] 根據(jù)克隆得到的灰飛風(fēng)RDL亞基的基因組序列，按照等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（AlleleSpecificPolymeraseQiainReaction，AS-PCR)引物設(shè)計(jì)原理和優(yōu)化原則， 將突變型基因的A2'N位點(diǎn)后的堿基位置作為反向引物的3'末端（也可作為正向引物的 末端，但因其GC%含量過高，故本試驗(yàn)選擇修飾反向引物），通過調(diào)整引物的長度（20bp左 右），使其退火溫度在50~60°C之間；再利用PrimerPremier5. 0軟件設(shè)計(jì)最佳的上游通 用引物。普通的AS-PCR引物僅是在引物3'末端的堿基有所差異，本試驗(yàn)為了提高AS-PCR 引物的特異性，在下游引物3'端的倒數(shù)第Ξ個(gè)堿基的位置又引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，最終形成 AS-PCR的下游引物，組成敏感/抗性引物對(duì)，克隆片段長度為26化P(序列表的序列1)。 陽〇17] 敏感引物對(duì)：
[0018] ASPCR-rdl-F607(序列表的序列 2) CCGAATCCCGTTGGTGTGTC
[0019] ASPCR-Srdl-R866(序列表的序列 3) ACCGTGGTGACGCCGAGAGC
[0020] 抗性引物對(duì)：
[0021] ASPCR-rdl-F607(序列表的序列 2) CCGAATCCCGTTGGTGTGTC
[0022] ASPCR-化dl-R866(序列表的序列 4) ACGGTGGTGACGCCGAGATT
[0023] 2.單頭灰飛風(fēng)基因組DNA的提取
[0024] (1)配制提取液A: 1 % (g/mL)SDS，50mmol/LTris·肥1，25mmol/L化Cl，25mmol/ L邸ΤΑ;提取液B:3mol/LKAC，PH= 7. 2。上述兩提取液的溶劑均為超純水，室溫保存； 陽0巧](2)將單頭灰飛風(fēng)試蟲置于無菌2.OmL的EP離屯、管中，放入滅菌后的鋼珠，加入 200μL的提取液A，用球磨儀進(jìn)行研磨；
[0026] 做將勻漿后的樣品65°C水浴比，每隔15min震蕩混勻，加速組織裂解；
[0027] (4)加入等體積（200μL)的提取液B，滿旋震蕩混勻，冰浴化； 陽02引 （5) 10, 000Xg離屯、15min，小屯、將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無菌1. 5血ΕΡ離屯、管中；
[0029] (6)加入3倍體積化00μL)預(yù)冷的無水乙醇，滿旋震蕩混勻，-20°C放置化；
[0030] (7) 10,OOOXg離屯、15min，棄盡上清液，用70% (mL/mL)乙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用）清洗兩 次；
[0031] (8)用ΙΟμΙ移液器吸盡管底70% (mL/mL)乙醇，空氣干燥沉淀20min，加入30μΙ 滅菌水溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?陽03引 3.等位基因特異性PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)
[0033] 為了最大程度提高等位基因特異性引物的專一性，試驗(yàn)針對(duì)AS-PCR反應(yīng)體系W 及PCR循環(huán)條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，最終確定了AS-PCR的反應(yīng)體系及PCR循環(huán)條件：
[0034] (1)在200μL滅菌PCR管中建立總體積為20μL的反應(yīng)體系：
[0035]
[0036] 似按W下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94°C預(yù)變性3min后，30輪循環(huán)：94°C變性30s，62°C 退火30s，72°C延伸30s;最后72°C延伸5min。
[0037] (3)電泳檢測(cè)：取10μΙ擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為 1ΧΤΑΕ，恒壓（120mV)電泳30min，DNAMarker(2000bp)，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并 拍照保存。
[003引 （4)等位基因特異性PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)
[0039] 4.ii序驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確性
[0040] 為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)在灰飛風(fēng)RDL亞基突變所處的外顯子7 (序列表的 序列5)適當(dāng)位置設(shè)計(jì)引物A2N-rdl-F693(序列表的序列6)和A2N-rcQ-R893(序列表的序 列7)，對(duì)已用電泳鑒定出純雜性的單頭飛風(fēng)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法參照上述3(1)部分， 取3μL電泳后條帶單一即可送測(cè)（測(cè)序引物為A2N-rdl-F693)，測(cè)序結(jié)果如附圖2所示，敏 感/抗性純合子在突變位置GTC(GC/AA)C為單一峰圖，而雜合子為雙峰，運(yùn)與AS-PCR檢測(cè) 結(jié)果一致。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 特異性引物組合由序列表的序列2、序列3和序列4所示的三個(gè)單鏈DNA分子組成。2. 權(quán)利要求1所述特征性引物組合主要用于鑒定灰飛虱離子型γ -氨基丁酸受體基 因與苯基吡唑類殺蟲劑有關(guān)的Α2' Ν突變，其特征在于所述的Α2' Ν突變位于灰飛虱離子型 γ -氨基丁酸受體RDL亞基基因開放閱讀框第283位氨基酸由Α突變?yōu)棣?. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述苯基吡唑類殺蟲劑為氟蟲腈、乙蟲腈和 丁烯氟蟲腈。4. 如權(quán)利要求2,其特征在于主要以下操作來實(shí)現(xiàn)： (a) 提取單頭灰飛虱成蟲基因組DNA; (b) PCR反應(yīng)體系(c) PCR反應(yīng)程序 94°(：預(yù)變性3!1^11;30輪循環(huán)：94°(：變性3〇8,62°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8 ;72°(：延伸 5min〇 (d) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 電泳檢測(cè)：取10 yL擴(kuò)增產(chǎn)物用2. 0%瓊脂糖凝膠在恒壓（120mV)電泳30min，用紫外 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照，其中用敏感引物對(duì)擴(kuò)增得到單一條帶的樣本個(gè)體為敏感純 合子，用抗性引物對(duì)擴(kuò)增得到的單一條帶的樣本個(gè)體為抗性純合子，用敏感/抗性引物對(duì) 擴(kuò)增得到的兩個(gè)條帶的樣本個(gè)體為雜合子。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)灰飛虱離子型γ-氨基丁酸受體基因突變的方法，主要通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：提取單頭灰飛虱成蟲基因組DNA；設(shè)計(jì)特異性引物；采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。該發(fā)明操作簡便、靈敏度高、時(shí)間短，它屬于害蟲抗藥性治理的范疇，對(duì)于監(jiān)測(cè)田間種群對(duì)苯基吡唑類殺蟲劑抗性基因頻率、指導(dǎo)合理用藥和延緩抗性發(fā)展具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105331612
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510755372
【發(fā)明人】高聰芬, 魏琪, 吳順凡, 王利祥, 慕希超
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2015年11月5日