Braf繼發(fā)突變的耐藥胃腸道間質(zhì)瘤細胞系及裸鼠模型構(gòu)建的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種胃腸道間質(zhì)瘤耐藥細胞系。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinalstromaltumor，GIST)是位于胃腸道或腹腔內(nèi) 的表達KIT(⑶117)蛋白的間葉源性腫瘤，絕大多數(shù)存在KIT基因的功能獲得性突變，KIT 基因突變在GIST發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。Imatinib是一種口服的ATP的競爭性抑制 劑，能競爭性地結(jié)合于KIT酪氨酸激酶功能區(qū)的ATP結(jié)合位點，阻斷磷酸基團從ATP上轉(zhuǎn)移 到蛋白質(zhì)底物（KIT，PDGFRA，ABL以及BCR-ABL融合蛋白）的酪氨酸殘基，從而阻斷了失控的 信號傳導(dǎo)通路，進而阻止細胞的持續(xù)增殖，并恢復(fù)細胞的正常凋亡程序，是靶向治療胃腸道 間質(zhì)瘤的重要藥物。然而一般在Imatinib平均治療24個月后，將產(chǎn)生耐藥，因此研究腫瘤 耐藥機制以及防止或逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的發(fā)生對于提高靶向治療效果十分重要。近年來，腫瘤 耐藥細胞系己成為重要的工具，大量研究利用它來揭示腫瘤細胞的耐藥機制、研究腫瘤細 胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)、開發(fā)及評價新的抗癌方法等。建立腫瘤耐藥細胞系具有重要應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是建立胃腸道間質(zhì)瘤Imatinib耐藥細胞系，為以下相關(guān)研究提供 耐藥腫瘤細胞模型：研究耐藥腫瘤細胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特點、研究腫瘤多藥耐藥機制、分 析靶向治療藥物敏感性及篩選靶向治療藥物、開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物、研發(fā)更有效的腫瘤 治療方法等。
[0004] -種BRAF繼發(fā)突變的耐藥胃腸道間質(zhì)瘤細胞系，保藏名為 甲磺酸伊馬替尼耐藥的胃腸道間質(zhì)瘤細胞系GIST-1114,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏編號：CCTCCNO:C201501，保藏日期：2015年1月22日；地址：湖北省武漢市 武昌區(qū)武漢大學(xué)，郵編430072。
[0005] 所述GIST-1114細胞系包含KIT基因exonllV559D原發(fā)突變和BRAF基因exonl5 V600E繼發(fā)突變；GIST-1114耐藥細胞系的移植瘤模型的組織形態(tài)學(xué)特征：發(fā)生耐藥后組織 形態(tài)學(xué)和免疫表型均發(fā)生了變化，從梭形細胞型變成混合細胞型，部分區(qū)域可見橫紋肌肉 瘤分化，橫紋肌肉瘤分化區(qū)域⑶117陰性表達，但是Desmin和Myogenin呈現(xiàn)陽性表達。
[0006] -種采用所述的細胞系的裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建方法，建立步驟如下： 實驗動物BALB/C/nu/nu品系裸鼠，無特殊病原體級，雌雄不限，鼠齡3~4周， 體重19.0 ± 2.0g;GIST-1114細胞系接種5只裸鼠，均接種于背部皮下；其飼養(yǎng)和實驗均 在無特殊病原體環(huán)境中進行； 耐藥GIST細胞接種裸鼠：收集耐藥GIST細胞系數(shù)目約1X107接種于裸鼠背部皮下，次 日記為接種第1天；每日觀察荷瘤鼠飲食情況、精神狀態(tài)、腫瘤大小與外觀，用游標(biāo)卡尺每 10天測量一次裸鼠體重（g)和腫瘤的最長縱徑（a)、與最長徑垂直的最長橫徑（b)，根據(jù)公 式V(腫瘤體積)=(1/2)Xab2計算出腫瘤體積，繪制移植瘤生長曲線；經(jīng)過中位時間約21天 的生長靜息期后，腫瘤生長速度逐漸加快，隨著接種時間的推移，腫瘤的生長逐漸加速，月中 瘤體積逐漸增大；從接種日期起，每10天計算移植瘤的體積描繪腫瘤生長曲線，GIST-1114 細胞成瘤率60%。
[0007] 本發(fā)明的有益效果： 我們發(fā)現(xiàn)了GIST和惡性黑色素瘤(一種在歐美國家發(fā)病率較高的惡性腫瘤)在發(fā)病機 制上有一定的相似之處。西方國家的惡性黑色素瘤主要是由于BRAF基因突變引起，少部分 是由于KIT基因突變導(dǎo)致。而我國的惡性黑色素瘤KIT基因的突變率較西方高，BRAF基因 突變率則相應(yīng)下降，KIT和BRAF基因突變患者約占總患者的45% (20%+25%)。因此我們借 鑒惡性黑色素瘤的成功經(jīng)驗，是否可能是由于下游的RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的二次突 變，而非KIT基因的繼發(fā)突變導(dǎo)致imatinib的繼發(fā)耐藥。基于以上科學(xué)推斷，我們進一步 設(shè)計了細胞和動物等基礎(chǔ)實驗，在體內(nèi)外證實了部分imatinib耐藥的GIST是由于KIT下 游的BRAF基因繼發(fā)突變引起的，并且BRAF抑制劑Vemurafenib(維羅非尼）可以很好地 克服繼發(fā)耐藥。因此，解決了臨床上部分GIST無KIT基因二次突變的imatinib繼發(fā)耐藥 的問題。
【附圖說明】
[0008] 圖1是倒置相差顯微鏡下Imatinib耐藥的GIST-1114細胞形態(tài)圖； 圖2GIST-1114細胞系體外Imatinib藥物敏感性試驗； 圖 3GIST-1114 耐藥前原發(fā)突變KIT基因exonllV559D(KITc.1676T>A(V559D)); 圖 4GIST-1114 耐藥后繼發(fā)突變BRAF基因exonl5V600E(BRAFc.1799T>A(V600E)); 圖5耐藥胃腸道間質(zhì)瘤裸鼠移植瘤生長曲線； 圖6GIST-1114移植瘤橫紋肌肉瘤分化區(qū)域HE染色； 圖7GIST-1114移植瘤橫紋肌肉瘤分化區(qū)域CD117(A部分)，Desmin(B部分)，Myogenin免疫組化染色（C部分)。
【具體實施方式】
[0009] 本發(fā)明的耐藥細胞系建立步驟如下：1例Imatinib600mg/d治療失敗的耐藥 GIST(根據(jù)GIST治療的療效評價Choi標(biāo)準(zhǔn)，CT提示腫瘤體積增加10%并且密度改變不符 合PR標(biāo)準(zhǔn)）實行減瘤術(shù)，切取部分新鮮無菌的胃腸道間質(zhì)瘤組織行原代細胞培養(yǎng)，建立 了GIST-1114耐藥細胞系。用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞耐藥指數(shù)，行耐 藥細胞系的基因突變分析，建立耐藥細胞系裸鼠移植瘤模型(成瘤情況和移植瘤生長曲線， 組織學(xué)特征，免疫組織化學(xué)檢測⑶117、Desmin、Myogenin，移植瘤基因突變分析)。我們發(fā) 現(xiàn)，GIST-1114有以下特點：耐藥的GIST原代細胞在倒置顯微鏡下呈互不重疊的單層，細 胞生長呈成纖維細胞狀，為梭型（圖1)。GIST-1114對Imatinib也具有較強的耐藥性，在 Imatinib藥物濃度在0. 05_3μΜ之間時對細胞系的生長基本沒有明顯影響，3_5μΜ時受到 輕度影響，但在>1〇μΜ的高藥物濃度下部分細胞的生長受到一定的抑制（圖2)。GIST-1114 細胞系包含KIT基因exonllV559D原發(fā)突變和BRAF基因exonl5V600E繼發(fā)突變（圖 3-4)，未發(fā)現(xiàn)TOGFRA基因突變。耐藥細胞系裸鼠移植瘤模型實驗顯示：隨著接種時間的推 移，GIST-1114腫瘤的生長逐漸加速，腫瘤體積逐漸增大，細胞成瘤率為：GIST-1114組80% (4/5)(圖5)。GIST-1114移植瘤形態(tài)學(xué)特征：發(fā)生耐藥后組織形態(tài)學(xué)和免疫表型均發(fā)生了 變化，從梭形細胞型變成混合細胞型，部分區(qū)域可見橫紋肌肉瘤分化，橫紋肌肉瘤分化區(qū)域 ⑶117陰性表達，但是Desmin和Myogenin呈現(xiàn)陽性表達。GIST-1114移植瘤細胞包含KIT 基因exonllV559D原發(fā)突變和BRAF基因exonl5V600E繼發(fā)突變。未發(fā)現(xiàn)TOGFRA基因突 變。
[0010] 實施例1 耐藥細胞系建立步驟如下： 1例Imatinib600mg/d治療失敗的耐藥GIST(根據(jù)GIST治療的療效評價Choi標(biāo)準(zhǔn)，CT提示腫瘤體積增加10%并且密度改變不符合PR標(biāo)準(zhǔn)）實行減瘤術(shù)，切取部分新鮮無菌 的胃腸道間質(zhì)瘤組織行原代細胞培養(yǎng)，部分新鮮組織標(biāo)本_80°C保存?zhèn)溆茫溆嗍中g(shù)標(biāo)本固 定、石蠟包埋后行HE和免疫組織化學(xué)檢查。
[0011] (1)組織塊培養(yǎng)法 取手術(shù)切除的新鮮胃腸道間質(zhì)瘤組織，仔細剔除外周可疑污染及壞死組織后，用0. 01mol/L的PBS液沖洗3次，再用含50(^g/ml慶大霉素、50(^g/ml鏈霉素、500U/ml青霉素的 無血清RPMI-1640沖洗5-6次，將組織剪成小塊，均勻地鋪在25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37°C， 5%C02的孵箱中培養(yǎng)。lh后，每孔加入培養(yǎng)基0. 5ml，繼續(xù)培養(yǎng)。第二天再加入培養(yǎng)基lml。 此后每3天換液一次。培養(yǎng)基為含15%FCS(胎牛血清）的RPMI-1640。
[0012] (2)消化培養(yǎng)法 取手術(shù)切除的新鮮胃腸道間質(zhì)瘤組織，仔細剔除外周可疑污染及壞死組織后，用〇. 01mol/L的PBS液沖洗3次，再用含50(^g/ml慶大霉素、50(^g/ml鏈霉素、500U/ml青霉素的 無血清RPMI-1640沖洗5-6次，用眼科剪盡量剪碎組織至直徑〈1mm，用無血清RPMI-1640洗 2次，加入2倍體積的lmg/ml的中性蛋白酶，37°C消化60min，收集單個及小塊組織的瘤細 胞，離心洗滌2次，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為含15%FCS的RPMI-1640。次日輕輕 吸棄上清液，換新鮮培養(yǎng)液，此后每隔3天換液一次。
[0013] 細胞耐藥后，及時凍存該濃度耐藥細胞于液氮中。凍存液由20%小牛血清、 5%DMS0、75%PMI1640培養(yǎng)液組成，凍存過程應(yīng)逐步降溫，采取4°C30分鐘一-20°C1小時 --70°C過夜一液氮的順序進行。凍存細胞的復(fù)蘇按以下程序進行：在一個25cm2的細胞 培養(yǎng)瓶中加入至少l〇ml含15%胎牛血清的培養(yǎng)液；從液氮中取出裝有細胞的凍存管，立即 放入37°C水浴輕輕搖動使凍存物在1分鐘內(nèi)解凍，用酒精棉球擦拭凍存管外壁后拿入超凈 臺；將解凍后的細胞懸液移入己加了培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，稍加搖動淚勻，擰松瓶蓋，平放入 二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37°C、5%C02、95%濕度條件下培養(yǎng)，約24小時細胞貼壁后換新鮮培養(yǎng) 液3~5ml繼續(xù)培養(yǎng)。
[0014] 實施例2 對建立的GIST-1114細胞系進行形態(tài)學(xué)觀察、生物學(xué)特性鑒定、基因突變檢測： 1.倒置相差顯微鏡觀察活細胞形態(tài) 剛分離接種的耐藥GIST-1114原代細胞大約12小時開始貼壁，48小時伸展開，72小時 完全伸展開，原代培養(yǎng)的細胞第5天起開始增殖，約10-12天可傳代。耐藥的GIST-1114細 胞在倒置顯微鏡下呈互不重疊的單層，細胞生長呈成纖維細胞狀，為梭型（圖1)。傳代1-2 代后，細胞生長加快，約5-7天傳代一次。傳代10-15代后原代細胞生長變慢，細胞倍增時 間延長，細胞皺縮，后出現(xiàn)衰老、死亡。
[0015] 2.Imatinib耐藥的人胃腸道間質(zhì)瘤細胞系的體外藥敏驗證 取對數(shù)生長期的GIST-1114細胞，常規(guī)用0. 25%胰蛋白酶消化各株細胞系，離心后棄上 清，用培養(yǎng)基重懸細胞后，細胞計數(shù)板計數(shù)調(diào)整細胞濃度為3X104/ml，以每孔10〇μ1接種于 96孔板，置于37°C，5%C02的孵箱中培養(yǎng)。24h后，加入不同終濃度lmatinib(0. 05-5〇μΜ)， 每個濃度設(shè)3個復(fù)孔并設(shè)對照孔。培養(yǎng)72h后