一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的瑪卡多糖及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的瑪卡多糖及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多糖(Polysaccharides)又稱(chēng)多聚糖，是一類(lèi)由α-或β-糖苷鍵相連的十個(gè)及十個(gè)以上單糖聚合而成的生物大分子，在能量?jī)?chǔ)存、結(jié)構(gòu)構(gòu)成及免疫防御等方面有極其重要的作用，是構(gòu)成生物體的四大基本物質(zhì)之一。自然界中90%以上碳水化合物均以多糖形式存在，廣泛存在于高等動(dòng)植物、藻類(lèi)、真菌、細(xì)菌等生物體的細(xì)胞膜上，具有控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與衰老等多種復(fù)雜的功能。近些年又發(fā)現(xiàn)多糖因可增進(jìn)機(jī)體免疫功能而有抑制腫瘤、抑菌解毒等作用，使國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)植物多糖的研究逐步深入，在我國(guó)如香菇多糖、黃芪多糖等研究均取得了很多成果。
[0003]瑪卡中糖類(lèi)含量比較高，據(jù)報(bào)道碳水化合物占總營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的59 %，每克瑪卡能提供2850卡路里的能量與此密切相關(guān)。而瑪卡糖類(lèi)組成中又以多糖的比例最大?，斂ㄖ械亩嗵前矸奂胺堑矸垲?lèi)的多糖?，斂ㄊ悄壳耙阎氖只谱魑镏形ㄒ坏囊环N富含淀粉的植物，這與其能抵抗安第斯高海拔山區(qū)寒冷、霜凍、晝夜溫差大等惡劣環(huán)境有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)瑪卡中非淀粉類(lèi)的的多糖報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)這方面進(jìn)行了研究，并對(duì)其結(jié)構(gòu)組成及其活性進(jìn)行了初步探討發(fā)現(xiàn)瑪卡多糖結(jié)構(gòu)較為均一，單糖組成簡(jiǎn)單，對(duì)機(jī)體細(xì)胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，這為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)理，開(kāi)發(fā)多糖類(lèi)免疫功能調(diào)節(jié)劑提供了理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的以瑪卡干片為原料，采用水提醇沉并經(jīng)過(guò)一系列的方法分離純化出具有免疫調(diào)節(jié)活性的多糖。運(yùn)用柱前衍生化法檢測(cè)其單糖組成，高效凝膠排阻色譜法檢測(cè)其分子量，并在細(xì)胞模型上初步驗(yàn)證其具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)多糖類(lèi)新藥提供了基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)以上目的:以瑪卡干片為原料，經(jīng)過(guò)脫脂后，熱水浸提，70?90%乙醇沉淀多糖，加水溶解沉淀物，再次醇沉得到粗多糖，通過(guò)DEAE-52纖維素(C1-型)樹(shù)脂加水洗脫，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、冷凍干燥得到純度較高的瑪卡多糖。
[0006]本發(fā)明制備出的瑪卡多糖經(jīng)過(guò)柱前衍生化及高效凝膠排阻色譜法分析后可知，單糖組成為葡萄糖、阿拉伯糖，其摩爾比為4?10: 1，分子量為10000?30000Da。
[0007]本發(fā)明制備出的瑪卡多糖經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，且毒性較低。
【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1九種單糖標(biāo)準(zhǔn)圖譜
[0009]圖2瑪卡多糖單糖組成圖譜
[0010]圖3瑪卡多糖分子量測(cè)定圖譜
[0011]圖4瑪卡多糖(LMP-1)對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7的增殖的影響
[0012]圖5瑪卡多糖(LMP-1)對(duì)巨噬細(xì)胞TLR樣受體及下游炎癥因子表達(dá)的影響
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋?zhuān)潜景l(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)該認(rèn)為屬于本發(fā)明范圍。
[0014]實(shí)施例1
[0015]瑪卡多糖的制備工藝路線(xiàn):
[0016](1)瑪卡干片用80?95%的乙醇回流脫脂，加入水使得料液比1: 15?25，沸水回流提取，反應(yīng)時(shí)間為1.5h。
[0017](2)用終濃度為70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀。
[0018](3)以1: 15?25的料液比用雙蒸水復(fù)水溶，60°C攪拌4h，離心回收上清，用終濃度為70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，得到粗多糖。
[0019](4)將上述粗多糖加雙蒸水配成濃度為15?25mg/mL的溶液，離心去上清備用。DEAE-52纖維素(C1-型)樹(shù)脂經(jīng)過(guò)活化后裝填至層析柱中，雙蒸水平衡，將離心后的多糖上清液溶液上樣，用雙蒸水作為洗脫液進(jìn)行洗脫，用硫酸蒽酮法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)多糖含量，直至流出液基本無(wú)多糖。
[0020](5)將含有多糖組分的水洗成分直接過(guò)濾除去雜質(zhì)、冷凍干燥得到瑪卡多糖(LMP-1)。
[0021]實(shí)施例2
[0022]瑪卡多糖的結(jié)構(gòu)鑒定
[0023](1)柱前衍生化法檢測(cè)其單糖組成
[0024]圖1為九種單糖標(biāo)準(zhǔn)圖譜，如圖中標(biāo)注所示九種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間的先后順序?yàn)楦事短恰⒑颂?、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、和巖藻糖，根據(jù)樣品中所出的峰及其出峰時(shí)間，可以比對(duì)判斷出樣品由葡萄糖、阿拉伯糖組成，如圖2所示，經(jīng)過(guò)計(jì)算可得葡萄糖、阿拉伯糖的摩爾比為4?10: 1。
[0025](2)高效凝膠排阻色譜法檢測(cè)其分子量
[0026]圖3為采用高效凝膠排阻色譜法測(cè)定瑪卡多糖分子量圖譜，通過(guò)GPC PostrunAnalysis分子量分析軟件，計(jì)算得到分子量校正曲線(xiàn)，從而計(jì)算出瑪卡多糖的分子量為10000 ?30000Dao
[0027]實(shí)施例3
[0028]瑪卡多糖的免疫調(diào)節(jié)活性初步研究
[0029](1)瑪卡多糖對(duì)鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7的增殖作用
[0030]對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞消化下來(lái)后進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3X 104/ml，接種到96孔板上，100 μ L/孔。置于C02恒溫培養(yǎng)箱，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的瑪卡多糖(終濃度為0，1.56，3.125，6.25，12.5，25，50 μ g/ml)，每個(gè)孔做4個(gè)重復(fù)，并加入LPS(1 yg/ml)做陽(yáng)性對(duì)照，刺激48h后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT方法測(cè)定細(xì)胞濃度。結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出瑪卡多糖在1.56,3.125,6.25，12.5 μ g/ml時(shí)能明顯促進(jìn)Raw264.7增殖，而濃度增高時(shí)對(duì)細(xì)胞的作用不明顯。因此接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中選用促增殖作用較強(qiáng)的低濃度劑量(1.56，3.125，6.25 μ g/ml)作為試驗(yàn)劑量探索其對(duì)細(xì)胞TLR樣受體及下游炎癥因子表達(dá)的影響。
[0031](2)瑪卡多糖對(duì)鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7TLR樣受體及下游炎癥因子表達(dá)的影響
[0032]以每孔3xl0~5個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中(每孔2ml)，細(xì)胞貼壁24h后加入不同終濃度的多糖(終濃度為1.56，3.125，6.25 μ g/ml)，同時(shí)設(shè)立空白組，LPS模型組(終濃度為1 μ g/ml)，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞提取總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR儀定量擴(kuò)增目的基因的cDNA，最后用瓊脂糖凝膠核酸電泳驗(yàn)證所提取擴(kuò)增的基因，用quantity one軟件進(jìn)行初步定量分析。結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出瑪卡多糖能明顯促進(jìn)TLR4，TLR2受體表達(dá)，具有一定的劑量依賴(lài)性。三個(gè)劑量的瑪卡多糖均能明顯促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，劑量稍高時(shí)(3.125，6.25 μ g/ml)能促進(jìn)IL-1 β的表達(dá)，只有當(dāng)濃度達(dá)到6.25 μ g/ml時(shí)才能刺激細(xì)胞分泌IL-6。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種瑪卡多糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)瑪卡干片用80?95%的乙醇回流脫脂，加入水使得料液比1: 15?25，沸水回流提取，反應(yīng)時(shí)間為1.5h。 (2)用終濃度為70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀。 (3)以1: 15?25的料液比用雙蒸水復(fù)水溶，60°C攪拌4h，離心回收上清，用終濃度為70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，得到粗多糖。 (4)將上述多糖加雙蒸水配成濃度為15?25mg/mL的溶液，離心去上清備用。DEAE-52纖維素(C1-型)樹(shù)脂經(jīng)過(guò)活化后裝填至層析柱中，雙蒸水平衡，將離心后的多糖上清液溶液上樣，用雙蒸水作為洗脫液進(jìn)行洗脫，用硫酸蒽酮法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)多糖含量，直至流出液基本無(wú)多糖。 (5)將含有多糖組分的水洗成分直接過(guò)濾除去雜質(zhì)、冷凍干燥得到瑪卡多糖(LMP-1)。2.權(quán)利要求1所述的瑪卡多糖(LMP-1)的提取工藝，其特征在于用80?95%的乙醇回流脫脂，用終濃度為70?90%的乙醇沉淀多糖，同時(shí)過(guò)DEAE-52纖維素(C1-型)樹(shù)脂得到純度較高的瑪卡多糖。3.權(quán)利要求2所述的瑪卡多糖(LMP-1)的結(jié)構(gòu)鑒定，其特征在于用柱前衍生化法檢測(cè)其單糖組成，高效凝膠排阻色譜法檢測(cè)其分子量，結(jié)果顯示其單糖組成為葡萄糖、阿拉伯糖，兩者摩爾比為4?10: 1，分子量為10000?30000Da。4.權(quán)利要求3所述的瑪卡多糖(LMP-1)的免疫活性研究，其特征在于瑪卡多糖具有促進(jìn)鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7的增殖作用，在濃度1.56,3.125,6.25 μ g/ml時(shí)效果明顯。刺激后的細(xì)胞TLR4，TLR2表達(dá)明顯增強(qiáng)，TNF- a、IL-1 β、IL-6的表達(dá)量增多，并具有一定的劑量依賴(lài)性。5.權(quán)利要求4所述的瑪卡多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或/和抗炎藥物，防癌抗癌、抗衰老、抗氧化中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種瑪卡多糖的制備方法及其免疫調(diào)節(jié)活性的初步研究，采用沸水浸提、乙醇醇沉、過(guò)DEAE-52纖維素樹(shù)脂等多種手段提取分離出純度較高的瑪卡多糖，檢測(cè)出其單糖組成為葡萄糖、阿拉伯糖，兩者摩爾比為4～10∶1，分子量為10000～30000Da，同時(shí)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提取的多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的活性及其TLR4，TLR2，炎癥因子的表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用。本發(fā)明的特點(diǎn)是：工藝流程簡(jiǎn)單，操作容易，成本較低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)；本發(fā)明提取的多糖具有防癌抗癌、抗衰老、抗氧化、對(duì)抗自身免疫性疾病等功效，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)多糖類(lèi)新藥提供了理論依據(jù)。
【IPC分類(lèi)】C08B37/00, A61P37/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105367677
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510872970
【發(fā)明人】樂(lè)龍, 闞紅金, 魏偉坤, 王瑩, 歐瑜, 尹鴻萍
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月1日