一種降解纖維素的嗜松青霉及其在秸稈發(fā)酵中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及一株高效降解纖維素的嗜松青霉（Penicillium pino地ilum)，W及其 在賴(lài)桿發(fā)酵中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是植物組織的基本成分，是地球上最豐富的多糖化合物，也是自然界中最 廉價(jià)、最豐富的可再生資源。目前除棉、麻、紙張和木材外，大部分纖維素還是W焚燒或廢物 的形式被處理掉，不僅造成大量資源的浪費(fèi)還導(dǎo)致環(huán)境污染。因此，纖維素的利用與轉(zhuǎn)化對(duì) 于解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問(wèn)題具有十分重要的意義。
[0003] 目前，對(duì)纖維素的糖化過(guò)程研究較多的是酸水解法和酶水解法。采用酶法轉(zhuǎn)化較 為簡(jiǎn)便，常溫、常壓條件下即可。纖維素酶，作為專(zhuān)一性水解纖維素的酶，廣泛應(yīng)用于食品和 環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域。微生物能根據(jù)不同的底物產(chǎn)生不同的酶，參與底物的降解反應(yīng)，從而達(dá)到 處理廢棄污染物的目的。產(chǎn)纖維素酶的微生物主要是真菌、細(xì)菌、放線菌及一些原生動(dòng)物， 用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多來(lái)源于真菌，真菌中對(duì)霉菌的研究最多，霉菌在降解纖維 素時(shí)，菌絲橫穿次生壁進(jìn)入胞腔，并不斷生長(zhǎng)，由內(nèi)而外降解纖維素，使纖維逐步被破壞。目 前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于真菌，研究較多的有木霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉 屬和漆斑霉屬等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一株高效降解纖維素的嗜松青霉W及其在賴(lài)桿發(fā)酵中的 應(yīng)用。 陽(yáng)〇化]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明所提供的具有高效降解纖維素的嗜松青霉DF13102,已于2015年7月9日 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)進(jìn)行了菌種保藏，并證明存 活，保藏登記號(hào)為CGMCCNo. 11062。保存地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所。 陽(yáng)007] 本發(fā)明所述的嗜松青霉DF13102,具有W下微生物特性：
[0008] 在±豆汁平板（PDA)上氣絲呈絮狀，初生氣絲白色，分生抱子灰綠至暗綠色，基絲 深紅至紫紅色，產(chǎn)紅色水溶性色素。分生抱子梗光滑，靑狀枝為對(duì)稱(chēng)二輪青霉組，排列緊 密；分生抱子近球形（圖1)。ITS基因序列參見(jiàn)序列表。根據(jù)菌落特征和顯微結(jié)構(gòu)特征 鑒定菌株DF13102為嗜松青霉（Penicilliumpino地ilum)，屬半知菌綱、叢梗抱目、叢梗抱 科、青霉屬。
[0009] 本發(fā)明嗜松青霉DF13102能夠產(chǎn)纖維素酶，可高效降解纖維素，有利于賴(lài)桿的生 物法降解和應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的嗜松青霉DF13102,分離自腐爛的香蕉賴(lài)桿。實(shí)驗(yàn)證明，該菌株接種賴(lài)桿 后可有效促進(jìn)賴(lài)桿的降解，是一株具有良好應(yīng)用前景的菌株。
[0011] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】 陽(yáng)01引 圖1為本發(fā)明所述菌株DF13102的抱子絲形態(tài)特征，X1000。 陽(yáng)01引圖2為本發(fā)明所述菌株DF13102與相關(guān)菌株基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明： 陽(yáng)01引 實(shí)施例1 :菌株DF13102CGMCCNo. 11062的篩選
[0016] 采集森林±壤、農(nóng)田±壤、菜園上、腐爛賴(lài)桿等樣品。稱(chēng)取5g樣品，加入裝有45ml 無(wú)菌水的Ξ角瓶中，30°C、180;r/min振蕩20min使充分分散。取上清，進(jìn)行1〇1~10 5梯 度稀釋?zhuān)謩e吸取各濃度樣品溶液0.1ml涂布于簇甲基纖維素鋼平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成份 為：簇甲基纖維素鋼（CMC-Na)20.Og，（畑4)25〇42.Og，Μ拆〇4· 7&0 0. 5g，KH2PO41.Og，化C1 0. 5g，pH7. 2,瓊脂20.Og，水1000ml，加入青霉素、鏈霉素使終濃度為lOOU/ml，W抑制細(xì)菌 生長(zhǎng)，便于真菌分離。28°C恒溫倒置培養(yǎng)，待有菌落長(zhǎng)出后，根據(jù)菌落的生長(zhǎng)速度、菌絲形 態(tài)、產(chǎn)抱情況、抱子顏色等挑取不同形態(tài)的單菌落，在PDA平板上進(jìn)行劃線純化。3(TC下恒 溫培養(yǎng)7化后，用剛果紅染色法篩選出透明圈較大的菌落，獲得菌株DF13102,保存。
[0017] 實(shí)施例2 :菌株DF13102CGMCCNo. 11062產(chǎn)纖維素酶酶活測(cè)定
[0018] 將菌株DF13102W1 %的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基（培養(yǎng)基組成為：稻草粉 3〇邑，麥教lOg，KH2PO42g，Μ拆〇4· 7&0 0. 3g，化5〇4· 7&0 5mg，化CI21. 7mg，aiClz1. 7mg， C0CI21. 7mg，MnS〇41.6mg，蒸饋水lOOOmL，pH7. 2-7. 4)，28°C、180r/min搖床培養(yǎng) 7d，取發(fā) 酵液4000r/min離屯、lOmin，取上清作為粗酶液，測(cè)定簇甲基纖維素酶（CMC酶）活性和濾 紙酶活性。W葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)，用DNS法測(cè)定0〇54。。定義Imin內(nèi)使底物產(chǎn)生1μL?ο?還原糖 (W葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶活單位扣/ml)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株DF13102的CMC 酶活和濾紙酶活分別為1.8U/ml和4. 2U/ml。
[0019] 實(shí)施例3 :菌株DF13102CGMCCNo. 11062的種屬鑒定
[0020] (1)形態(tài)與培養(yǎng)特性
[0021] 菌株DF13102在PDA培養(yǎng)基上氣絲絮狀，初生氣絲白色，分生抱子灰綠至暗綠色， 基絲深紅至紫紅色，產(chǎn)紅色水溶性色素。分生抱子梗光滑，靑狀枝為對(duì)稱(chēng)二輪青霉組，排列 緊密；分生抱子近球形（如圖1所示）。
[0022] (2)ITS序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析
[0023] 通過(guò)測(cè)序獲得菌株DF13102的ITS序列52化P(見(jiàn)序列表）。將ITS序列提交 GenBank進(jìn)行BLAST分析結(jié)果顯示，與該菌株同源性較高的菌株多為青霉菌屬，選擇相關(guān) 菌株在MEGA5. 0中利用Nei曲bor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（如圖2所示），DF13102 與Penicilliumpinophilum、Penicilliumverruculosum、Talaromycespinophilus、 Talaromycesverruculosus、Trichodermaviride、Acremoniumcellulolyticus聚為一個(gè) 大分支。
[0024] 比較菌株的形態(tài)與培養(yǎng)特征，發(fā)現(xiàn)菌株DF13102與化nicilliumpino地ilum的菌 落顏色與形態(tài)相似，產(chǎn)水溶紅色性色素，抱子梗掃靑狀分枝，呈典型的二輪對(duì)稱(chēng)。而與其它 菌株形態(tài)特征存在明顯差異。根據(jù)菌落特征、顯微結(jié)構(gòu)特征和ITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，鑒定菌 株DF13102 為嗜松青霉（Penicilliumpino地ilum)。
[0025] 本發(fā)明設(shè)及的菌株DF13102(CGMCCNo. 11062)，經(jīng)分類(lèi)鑒定，屬于半知菌綱、叢梗 抱目、叢梗抱科、青霉屬，命名為嗜松青霉（Penicilliumpino地ilum)，于2015年7月9日 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)進(jìn)行了菌種保藏，并證明存 活，其保藏登記號(hào)為CGMCCNo. 11062。保存地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所。
[0026] 實(shí)施例4 :菌株DF13102CGMCCNo. 11062降解香蕉賴(lài)桿效果
[0027] 將菌株DF13102接種于W香蕉賴(lài)桿為唯一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成 為：香蕉賴(lài)桿粉 30g，（畑4)25〇4 1. 4g，皿2?〇42.Og，α?ζΝζΚΟ0. 3g，CaC!20. 3g，Μ拆〇4· 7&0 0. 3g，F(xiàn)eS〇4· 7&0 5.Omg，ZnS〇4· 7&0 1. 4mg，MnS〇4· &0 1. 6mg，C0CI22.Omg，水 1000ml， pH7. 2。接種量2%，搖瓶培養(yǎng)16d，測(cè)量香蕉賴(lài)桿干重的失重率。失重率（％ ) = (ml-m2)/ mlX100,其中ml為發(fā)酵前香蕉賴(lài)桿干重（g)，m2為發(fā)酵后香蕉賴(lài)桿干重（g)。
[0028] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵16d時(shí)真菌降解的香蕉賴(lài)桿量為36. 7%。
[0029] 序列表
[0030] 序列表巧22bp)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株降解纖維素的真菌，其特征在于降解纖維素的真菌為嗜松青霉（Penicillium pinophilum)DF13102,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為 CGMCCNo. 11062。2. 權(quán)利要求1所述真菌的特征在于，其ITS的序列為： GAGGTCACCGTGGTAAAAAAAACATGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCCTCCCGAGCGAGTGACAGAGC CCCATACGCTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCGGGGGGACCACACCCAACACAC AAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAA AGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACC AAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACAATTTTCATAGTACTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGC TTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGTGCGTCCCCCGGCGACCAGGTGGCCCCGGTGGGCCCGCCAAAGCAACAGGTG TATAGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGCCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGC〇3. 權(quán)利要求1所述真菌的應(yīng)用，其特征在于嗜松青霉（Penicilliumpinophilum) DF13102菌種發(fā)酵液中CMC酶活和濾紙酶活分別為1. 8U/ml和4. 2U/ml。4. 權(quán)利要求1所述真菌的應(yīng)用，其特征在于嗜松青霉（Penicilliumpinophilum) DF13102在秸桿發(fā)酵中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求4所述嗜松青霉DF13102在秸桿發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于，對(duì)香蕉秸桿纖 維素有明顯的降解作用，發(fā)酵16d時(shí)降解的香蕉秸桿量為36. 7%。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株高效降解纖維素的真菌及其在秸稈發(fā)酵中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。所述真菌DF13102分離于腐爛的香蕉秸稈，鑒定為嗜松青霉(Penicillium？pinophilum)，該菌株于2015年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC？No.11062。利用嗜松青霉DF13102降解纖維素，能有效促進(jìn)秸稈的降解，可廣泛應(yīng)用于秸稈發(fā)酵領(lǐng)域。CGMCC No.1106220150709
【IPC分類(lèi)】C12R1/80, C12N1/14
【公開(kāi)號(hào)】CN105368715
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510591081
【發(fā)明人】黃惠琴, 鮑時(shí)翔, 易子霆, 朱軍, 孫前光, 劉敏, 鄒瀟瀟
【申請(qǐng)人】中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年9月9日