楸樹扦插不定根數(shù)主效基因位點qRN4的分子標記方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明提供了揪樹桿插不定根數(shù)主效基因位點qRN4的分子標記方法，屬于分子 遺傳學領域，專用于定向培育桿插生根能力高的揪樹新品種。
【背景技術】
[0002] 揪樹（仍紅如a/wwei)屬于紫蔵科（仿如口打iaceae)梓屬（仍紅如a)的優(yōu)良珍貴 用材樹種。隨著工業(yè)的發(fā)展和世界人口的增長、木材需求與日劇增，木材短缺已成為世界性 問題，我國尤為突出。發(fā)展無性系林業(yè)成為緩解我國木材短缺問題的有效途徑，而桿插生根 率是制約無性系林業(yè)發(fā)展的瓶頸。揪樹為桿插生根率低且生根數(shù)少的樹種，桿插生根困難 及桿插苗長勢弱限制了揪樹無性系林業(yè)的發(fā)展。因此挖掘與桿插不定根數(shù)相關的標記位點 對培育速生揪樹新品種具有重要的意義。
[0003] SSR分子標記是目前應用最廣泛的分子標記技術之一，被廣泛的應用于基因定 位、Q化定位、標記輔助育種和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等方面。陳永霞等（陳永霞，張新 全，馬嘯，謝文剛.SSR標記與扁穗牛鞭草農(nóng)藝性狀關聯(lián)分析.湖北農(nóng)業(yè)科學，2011， 50 (7) : 1494-1498.)選用10對SSR引物對44份外部形態(tài)差異較大的扁穗牛鞭草進行掃描， 進行性狀與SSR標記的關聯(lián)分析，其中找到18個SSR標記與8個農(nóng)藝性狀顯著相關，并篩 選出優(yōu)異種質(zhì)，加快扁穗牛鞭草的育種進程。
[0004] 前期研究發(fā)現(xiàn)不同揪樹無性系間桿插生根能力存在顯著差異，根據(jù)生根率、單株 生根數(shù)和單株最長根長等3個指標可W將其分為生根能力較差、生根能力中等、生根能力 較好和易生根類等4個組（馬玲玲，王鵬，張振宇，李林芳，楊如同，李亞.梓屬植 物嫩枝桿插生根能力的評價.北方園藝，2014，（15): 72-77.)。該研究結(jié)果表明利用揪 樹無性系群體開展關聯(lián)分析，可能檢測到桿插不定根數(shù)相關的主效基因或分子標記。目前 還未見開展相關研究的論文或?qū)＠?br>
【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是公布揪樹桿插不定根數(shù)主效基因位點及其分子標記。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過W下技術方案實現(xiàn)的：利用SSR分子標記引物CB250的正向 引物序列 5' -CCTCGTTGTAGGGCAGGATA-3' 和反向引物序列 5' -GAATACGCAAGCACGTTTGA-3' 結(jié)合PCR技術擴增揪樹嫩葉的基因組DNA，如果能擴增出190bp的DNA片段，則表明揪樹 桿插不定根數(shù)主效基因位點qRN4的存在，利用TASS化2. 1軟件的GLM程序測得對揪樹桿插 不定根數(shù)的貢獻率為10. 72%。
[0007] 有益效果：本發(fā)明首次公布了一個揪樹桿插不定根數(shù)的主效基因位點及其分子標 記，該標記將有利于縮短揪樹的育種周期，降低育種成本，定向培育桿插生根能力高的揪樹 品種，進而加速揪樹的推廣，最終為在緩解我國的優(yōu)質(zhì)木材短缺的問題上發(fā)揮重要的作用。
【具體實施方式】
[000引揪樹桿插不定根數(shù)統(tǒng)計分析：2013年3月上旬和2014年3月上旬，將87個揪樹無 性系的五年生枝條截成30cm長后均勻地邸置于平整的沙床內(nèi)，然后覆蓋3~5cm的細沙， 誘透水。每周用500倍的多菌靈濁液噴灑誘透沙床。將泥炭和珍珠巖按1:1的體積比混勻 后裝進育苗盆(規(guī)格為15X15X20cm)中并用500倍的多菌靈濁液噴灑誘透。當沙床內(nèi)新 萌發(fā)的嫩枝高度達到10~15cm時，去掉嫩枝的頂端，一周后，將嫩枝帶遲取下，作為插穗。 將插穗上的葉片連同葉柄一起剪掉，只剩頂部的一片葉子，并將其剪掉一半。將處理好的插 穗基部浸薩75%的酒精消毒30s，用清水沖洗干凈，然后在3, 000mg/L的IBA中浸薩Imin， 將插穗插入育苗盤，每個穴杯插1根，深度為插穗長度的1/2~2/3。每個無性系桿插20個 插穗，重復3次。桿插完之后用85%遮陰網(wǎng)遮蓋防曬，自動噴霧裝置噴霧給水。每周用500 倍的多菌靈濁液噴灑誘透。桿插后70天統(tǒng)計各無性系不定根數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)揪樹不同無性系 間的不定根數(shù)差異極大，不定根數(shù)變幅為1. 0條/株~14. 2條/株。
[0009] 揪樹群體遺傳結(jié)構(gòu)分析：利用CTAB法提取揪樹嫩葉基因組DNA，然后用277對SSR 引物隨機PCR擴增12個揪樹無性系DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70對引物可W成功的擴增出條帶清晰 且多態(tài)性好的條帶，合成引物的可用性為25. 26%。70對SSR引物的多態(tài)性頻率介于40%~ 100%，平均的多態(tài)性頻率為87. 17%，多態(tài)性豐富(表1)。SSR引物由南京思普金生物科技 有限公司合成。PCR擴增體系為10μL包括20ng基因組DNA，2. 5mM的MgC12,0. 5mM的 dNTPs，20ng的引物，0. 5U化qDNA聚合酶。PCR反應程序為：94°C預變性5分鐘，94°C變 性30秒，57°C退火45秒，72°C延伸60秒，循環(huán)32次，最后72°C延伸5分種。PCR反應 在伯樂T100PCR儀上完成。PCR擴增產(chǎn)物檢測：利用8%濃度的聚丙締酷胺凝膠電泳，進行 PCR產(chǎn)物檢測，上樣量為1. 5化，電泳緩沖液為1XTBE，電壓設為220V，電泳至漠酪藍帶跑 出膠最低端為止。膠片用銀染方法染色：先用固定液(去離子水、10%乙醇、1%乙酸)固定10 min,再1. 5%硝酸銀溶液浸泡10min,去離子水迅速洗涂2遍后，顯色液(去離子水、1. 5%氨 氧化鋼、1%甲醒）顯色10min,最后用去離子水沖洗，放入膠片觀察燈上拍照。W二進制記 錄SSR引物擴增結(jié)果，同一位點上具有相同遷移率的條帶記為1，無帶記為0,獲得87個揪 樹無性系的基因型數(shù)據(jù)。利用Structure2.1軟件結(jié)合基因型數(shù)據(jù)對梓屬群體結(jié)構(gòu)進行 分析，結(jié)果表明對應似然值InP(D)隨K值的增大而持續(xù)增大，因此參照Evanno等巧vanno G,民egnautS,GoudetJ.Detectingthenumberofclustersofindividualsusing 化esoftwareSTRUCTU肥：asimulations化dy.Molecularecology, 2005，14 巧）： 2611-2620.)通過ΔK來確定K值。ΔK在K=7時出現(xiàn)峰值，所W87份揪樹材料可被分為 7個亞群。將Κ=7代入structure軟件重新運算，得到各個材料的對應Q值，作為下一步生 根性狀與SSR標記關聯(lián)分析的協(xié)變量，可W有效降低群體結(jié)構(gòu)對關聯(lián)分析的影響。
[0010] 揪樹連鎖不平衡分析：通過對70個SSR標記486個位點分析，表明在117, 855個 成對組合的SSR位點中，存在一定程度的LD。統(tǒng)計概率（P< 0. 01)支持的LD成對位點 77, 106個，占全部位點組合的65. 42%，平均值為0. 557,值在0. 4W上的LD位點組合數(shù)為 42, 523,占總LD位點組合數(shù)的55. 15%，其中位于0. 8-1之間的位點數(shù)最多，有29, 667個，W 上均說明位點間整體LD水平較高。
[0011] 揪樹桿插生根率的關聯(lián)分析：利用TASS化2. 1軟件的GLM程序W87個無性系對應 的Q值為協(xié)變量，將70個SSR標記與桿插不定根數(shù)進行線性回歸分析，結(jié)果檢測到4個桿 插不定根數(shù)的0化，分別命名為qRNl~qRN4。giL位點qRN4緊密連鎖的標記為CB250,解釋 的表型變異率為10. 72%。CB250的正向引物序列是：5' -CCTCGTTGTAGGGCAGGATA-3'，反向 引物序列為：5' -GAATACGCAAGCACGTTTGA-3'，擴增片段大小為190bp。
[0012] 表1 70對SSR引物的擴增片段多態(tài)性
【主權(quán)項】
1.楸樹扦插不定根數(shù)主效基因位點qRN4的分子標記方法，其特征在于：利用SSR分子標記引物CB250的正向引物序列5 ' -CCTCGTTGTAGGGCAGGATA-3 '和反向引物序列 5 ' -GAATACGCAAGCACGTTTGA-3 '結(jié)合PCR技術擴增楸樹嫩葉的基因組DNA，如果能擴增出190 bp的DNA片段，則表明楸樹扦插不定根數(shù)主效基因位點qRN4的存在，利用TASSEL2. 1軟件 的GLM程序測得對楸樹扦插不定根數(shù)的貢獻率為10. 72%。
【專利摘要】本發(fā)明提供了楸樹扦插不定根數(shù)主效基因位點qRN4的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域。利用70對SSR分子標記確定楸樹87份無性系的基因型結(jié)合其扦插不定根數(shù)進行全基因組關聯(lián)連鎖分析，檢測到楸樹扦插不定根數(shù)主效基因位點qRN4，解釋10.72%表型變異，SSR分子標記CB250與之極顯著相關。本發(fā)明不但有助于解決我國楸樹育種進展遲緩的問題，而且有助于解決現(xiàn)有育種技術對提高楸樹扦插不定根數(shù)成本高、時間長、穩(wěn)定性低等技術難題，將加快我國楸樹新品種培育與無性系林業(yè)發(fā)展。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105368964
【申請?zhí)枴緾N201510956023
【發(fā)明人】王鵬, 楊如同, 李林芳, 李亞, 馬玲玲, 王淑安, 汪慶
【申請人】江蘇省中國科學院植物研究所
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月21日