一種芒草白斑病的分子檢測(cè)方法
【專利說(shuō)明】-種苦草白斑病的分子檢測(cè)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于植物病蟲(chóng)害檢疫領(lǐng)域，具體設(shè)及一種芒草白斑病的分子檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引芒草（ifiscan施W)是禾本科、C4多年生草本植物，由于芒草具有高光和效率、低C〇2排放、富含纖維質(zhì)等優(yōu)良特質(zhì)，被認(rèn)為是最具潛在價(jià)值的生物能源植物。近年來(lái)，隨著芒 草在生物質(zhì)能源方面的逐步應(yīng)用，使大規(guī)模生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。但因其常年無(wú)性繁殖，使一些疾 病積累，產(chǎn)量和品質(zhì)無(wú)法得到保證。白斑病是禾本科植物中的常見(jiàn)疾病，在其它禾本科植物 中玉米、水稻和高梁均有白斑病的相關(guān)報(bào)道，白斑病導(dǎo)致作物減產(chǎn)，危害巨大。因此，提早發(fā) 現(xiàn)致病菌病原并提前預(yù)防能夠減少損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了泛生菌屬（Pantoea)可W感染芒草使芒草患白斑病，本發(fā)明的目的 在于提供一種芒草白斑病的分子檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，為芒草白斑病的 防治、檢測(cè)提供有效手段。 陽(yáng)0化]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種芒草白斑病的分子檢測(cè)方法，該方法利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)對(duì)芒草中白斑病 進(jìn)行快速檢測(cè)，所用引物序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
[0006] 優(yōu)選的，所述的芒草白斑病的分子檢測(cè)方法包括如下步驟： (1)設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)芒草白斑病的特異性引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
[0007] (2)提取芒草基因組DNA作為PCR的模板。
[0008] (3)配制50μLPCR反應(yīng)體系：DNA聚合酶（2U/μL)2μレ10XDNA聚合酶Buffer 5yL，20mMMgClz4yL，10mMdNTPs3yL，上下游引物各（20μM)2μL，DNA模板（10ng/ μL) 2μL，(1地2〇 30μL。
[0009] (4)按如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C10s，30 個(gè)循 環(huán)；72°C5min。
[0010] (5)PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若凝膠電泳結(jié)果有l(wèi)(K)bp電泳條帶， 表明測(cè)試樣品為白斑病患病植株，判為陽(yáng)性；若凝膠電泳結(jié)果無(wú)l(K)bp的電泳條帶，表明測(cè) 試樣品為健康植株，判為陰性。 W11] -對(duì)檢測(cè)芒草白斑病的特異性引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
[0012]本發(fā)明利用PCR高效擴(kuò)增技術(shù)的特異性強(qiáng)及方便快捷的特點(diǎn)，為芒草白斑病致病 菌的檢測(cè)、防治提供了有效手段。本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)和效果： (1)首次發(fā)明芒草白斑病的快速檢測(cè)方法。
[0013] (2)檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、靈敏、引物針對(duì)性和特異性高而且成本低。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是不同樣品PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，Μ為DNA Marker,泳道1-7的DNA 模板分別為健康芒草、致病菌感染的芒草、枯草芽抱桿菌、大腸桿菌、±壤芽抱桿菌、乳酸 菌、假單胞菌的基因組DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0015]W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均在常 規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)。
[0016] 實(shí)施例1 選取健康芒草植株、泛生菌屬感染的芒草植株作為檢測(cè)樣品，并W枯草芽抱桿菌、大腸 桿菌、±壤芽抱桿菌、乳酸菌、假單胞菌等基因組DNA作為對(duì)照。
[0017] (1)針對(duì)芒草白斑病致病菌泛生菌屬的leSrDNA中間部分核屯、核酸序列的特殊位 點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。 陽(yáng)0化](2)取芒草葉化采用植物DNA提取試劑盒提取芒草的基因組DNA。
[0019] (3)采用鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司的PCR試劑配制50μL PCR反應(yīng)體系：DNA聚合酶 (2U/μL)2μL，10XDNA聚合酶Buffer5μL，20mMMgCl2 4μL，10mMdNTPs3μL，上下游 引物各（20μ Μ)2μ L，DNA模板（lOng/μ L)2μ L，d地2〇30μ L。
[0020] (4)按如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C10s，30 個(gè)循 環(huán)；72°C5min。
[0021] (5 )PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1中，M為DNA Marker， 泳道1-7的DNA模板分別為健康芒草、致病菌感染的芒草、枯草芽抱桿菌、大腸桿菌、±壤芽 抱桿菌、乳酸菌、假單胞菌的基因組DNA。從圖中可W看出，只有致病菌感染的芒草擴(kuò)增出 lOObp左右的條帶(泳道2)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，健康芒草及其它菌株的檢測(cè)結(jié)果為陰性。由 此可見(jiàn)，本發(fā)明的引物針對(duì)性和特異性極高，能夠快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)出染病植株。
[0022] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種芒草白斑病的分子檢測(cè)方法，其特征在于：所述的分子檢測(cè)方法為PCR法，所用 引物序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芒草白斑病的分子檢測(cè)方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)芒草白斑病的特異性引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA; (2) 提取芒草基因組DNA作為PCR的模板； (3) 配制50 4 1^?〇?反應(yīng)體系：21]/^1^0嫩聚合酶2 4 1^10\0嫩聚合酶81^€615 4 1^， 20禮1%(：124 4 1^1〇1111(1犯1^3 4 1^2(^]\1上下游引物各2 4 1^10即/^1^0嫩模板2 4 1^ ddH20 30μL； (4) 按如下程序進(jìn)行？0?反應(yīng)：94￡€511^11;941€3〇8,65 1€3〇8,72°(：1〇8,30個(gè)循環(huán)； 72°C5min； (5) PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若凝膠電泳結(jié)果有100bp條帶，表明測(cè)試 樣品為白斑病患病植株，判為陽(yáng)性；若凝膠電泳結(jié)果無(wú)l〇〇bp條帶，表明測(cè)試樣品為健康植 株，判為陰性。3. -對(duì)檢測(cè)芒草白斑病的特異性引物，其特征在于：序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種芒草白斑病的分子檢測(cè)方法，屬于植物病蟲(chóng)害檢疫領(lǐng)域。本發(fā)明的分子檢測(cè)方法為PCR法，所用引物為：上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG，下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。通過(guò)提取待檢植株的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)是否擴(kuò)增到目的片段來(lái)判定測(cè)試樣品是否為白斑病患病植株。本發(fā)明利用PCR高效擴(kuò)增技術(shù)的特異性強(qiáng)及方便快捷的特點(diǎn)，為芒草白斑病致病菌的檢測(cè)、防治提供了有效手段。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105368977
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510967853
【發(fā)明人】趙玲玲, 刁英, 胡小虎, 胡中立
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月21日