一種抑制水稻細菌性條斑病菌生長的化合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物的新用途，闡明藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)與細菌的生物活性之間的關(guān)系， 更具體的說，是探索化合物對水稻細菌性條斑病菌的抑菌和殺菌活性。
【背景技術(shù)】
[0002] 在1918年Reinking首先報道了菲律賓水稻上發(fā)生細菌性條斑病，后來陸續(xù)在東 南亞地區(qū)澳大利亞及非洲一些地區(qū)有見報道，目前在我國南方稻區(qū)危害嚴重。
[0003] 水稻細菌性條斑病，簡稱水稻細條病，是一種主要發(fā)生于我國南方的病害。在我 國，于20世紀50年代在廣東省首先發(fā)現(xiàn)該病害。方中達等將該病與白葉枯病區(qū)分開來，確 認為一種新的細菌性病害，屬黃單胞桿菌。水稻受水稻細條病菌侵染后，葉片變黃甚至枯 死，空秕粒增多，千粒重降低。一般年份，可減產(chǎn)10.20% ;在氣候條件適宜時，該病容易發(fā) 生流行，產(chǎn)量損失高達40%。1983年將水稻細條病列入國內(nèi)調(diào)運植物檢疫對象。
[0004] 水稻細條病在發(fā)病初期表現(xiàn)為在葉脈間出現(xiàn)像是被水浸透的細小線型病斑，一般 為深綠色，隨著侵染時間的發(fā)展，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色和灰白相間，病斑變大，但發(fā)病嚴重時 可使葉片完全變褐，導(dǎo)致葉片死亡。在潮濕條件下，可以在葉片表面觀察到黃色液滴，里面 包含大量的細條病菌細胞。在高濕條件下，易發(fā)病，遭遇暴雨或大風(fēng)葉片產(chǎn)生傷口，會流行。 一般糯稻比梗稻、秈稻感病，雜交稻比常規(guī)稻發(fā)病嚴重，品種間抗性差異顯著。偏施有機肥、 氮肥或灌水過深都可以加重病害。病菌主要依附在病稻種、稻草和自生稻上越冬，成為主要 初侵染源。病菌主要從氣孔或傷口侵入，借風(fēng)、雨、露等傳播。在無病區(qū)主要通過帶菌種子 傳入。晚稻在孕穗、抽穗階段發(fā)病嚴重。發(fā)病輕的田塊減產(chǎn)10%左右，重病田減產(chǎn)20~30%， 特重病田可達60%以上。
[0005] 水稻細條病主要分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。在國外，自1957年以來，東南 亞、南亞和西非的一些國家和地區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)了細條病。在我國主要分布于華南、華中和西南 等地區(qū)。稻種的南繁、病區(qū)調(diào)種及大面積推廣雜交水稻致使該病蔓延擴散，最北己達北煒 29. 5°左右，即在我國的8個稻作區(qū)中的華南雙季稻作區(qū)、華中單雙混栽稻作區(qū)、西南高原 稻作區(qū)中廣泛流行，并上升為水稻的主要病害之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用體外抗菌試驗，研究化合物對水稻細菌性條斑病菌的生物活性。
[0007] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下： 本發(fā)明的創(chuàng)新點是發(fā)現(xiàn)化合物對水稻細菌性條斑病菌有良好的抑菌和殺菌活性，并測 量得到其最小抑菌濃度MIC值和最小殺菌濃度MBC值，屬于首次公開。
[0008] 所述化合物結(jié)構(gòu)特征如下式所示：

【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合具體實施實例，進一步詳細地說明本發(fā)明。應(yīng)理解下面實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0010] 實施實例1 測量最小抑菌濃度MIC值。
[0011] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加 1000 mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0012] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加 1000 mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0013] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。
[0014] (4)菌液配制及計數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數(shù)法進行計數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50 μ L，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。培養(yǎng)后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。
[0015] 計算公式為：菌液濃度=nX20X 100cfu/mL (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0016] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小抑菌濃度MIC (Minimal Inhibitory Concentration)。MIC為最小抑菌濃度，即藥物 與一定濃度的菌液作用后，能夠抑制可見菌生長的最低濃度。
[0017] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256以 8/11^，在96孔板上1~10行，每孔加10(^1^不同濃度的藥液和10(^1^ 菌液，使最終菌液濃度為1~5 X 105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照，第 12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物最 低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC，每個實驗重復(fù)三次。
[0018] 測得最小抑菌濃度MIC值為32 μ g/mL。
[0019] 實施實例2 測量最小殺菌濃度MBC值。
[0020] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加 1000 mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0021] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加 1000 mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0022] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。
[0023] (4)菌液配制及計數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數(shù)法進行計數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50 μ L，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。培養(yǎng)后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)；計算公式為：菌液濃 度=nX20X 100cfu/mL。
[0024] (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0025] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小殺菌濃度MBC (Minimal Bactericidal Concentration)。在MIC基礎(chǔ)上，從每管吸取 10 μ L溶液，點于固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)按MIC培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，以完全殺滅細菌的最低濃度 為最小殺菌濃度(菌落數(shù)小于等于5)。
[0026] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256以 8/11^，在96孔板上1~10行，每孔加10(^1^不同濃度的藥液和10(^1^ 菌液，使最終菌液濃度為l~5X10 5cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照， 第12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物 最低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC。將上述未見生長細菌的各孔中的肉湯取 10 μ L接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，做好標記，于28°C培養(yǎng)24h，以仍無細菌生長的管內(nèi)藥物濃 度記為該藥的MBC，每個實驗重復(fù)三次。
[0027] 測得最小殺菌濃度MBC值為128 μ g/mL。
【主權(quán)項】
1. 一種抑制水稻細菌性條斑病菌生長的化合物，其特征在于： (1) 結(jié)構(gòu)特征如下式所示：(2) 其可作為水稻細菌性條斑病菌的抑制劑和殺菌劑； (3) 其對水稻細菌性條斑病菌的最小抑菌濃度MIC值為32μg/mL; (4) 其對水稻細菌性條斑病菌的最小殺菌濃度MBC值為128μg/mL。
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對水稻細菌性條斑病菌具有抑菌和殺菌活性的化合物。其水稻細菌性條斑病菌的最小抑菌濃度MIC值為32μg/mL，最小殺菌濃度MBC值為128μg/mL。
【IPC分類】A01P1/00, C07D413/04
【公開號】CN105384732
【申請?zhí)枴緾N201510722685
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】許自協(xié)
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年10月31日