從飛龍掌血中分離純化茴芹香豆素的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從民族藥飛龍掌血中分離純化高純度茴 芹香豆素單體的方法及其止血應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 飛龍掌血為蕓香科飛龍掌血屬植物飛龍掌血Tbi/Wia asiaiica ( L. ) Lam.的 干燥根或根皮，是一種西南地區(qū)少數(shù)民族習(xí)用的民族藥物，其化學(xué)成分主要集中于香豆素 類和生物堿類成分 [1]，具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性。目前從飛龍掌血中分離得 到了毛兩面針?biāo)兀╰oddalolactone)，九里香內(nèi)酯（coumurrayin)，花椒素（suberosin)和珊 瑚菜內(nèi)酯（phellopterin)等多種簡(jiǎn)單香豆素類成分 [2]。
[0003] 茴芹香豆素在飛龍掌血中含量較高，文獻(xiàn)報(bào)道其具有鎮(zhèn)痛抗炎等生物活性，目前 尚未有文獻(xiàn)報(bào)道純度高、收率高達(dá)80%以上茴芹香豆素的分離純化方法。
[0004] 專利申請(qǐng)人在前期研究中以飛龍掌血（TbWaJia asiaiica「Z.」Za?.)的根或 根皮為原料，粉碎后用乙醇溶液提取，再經(jīng)溶劑系統(tǒng)萃取，取氯仿萃取層經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純 化后制得飛龍掌血的提取物，藥理實(shí)驗(yàn)證明其具有顯著的止血活性，目前有關(guān)茴芹香豆素 單體止血活性的應(yīng)用尚屬于空白。
[0005] [1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草，苗藥卷.貴陽(yáng)，貴州科技 出版社，2005.
[2]郝小燕，彭琳，葉蘭，等.飛龍掌血生物總堿抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究.中西醫(yī)結(jié) 合學(xué)報(bào)，2004，2(6): 450-452。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的，在于從民族藥飛龍掌血中快速、高效提取高純度的茴芹香豆素，通 過(guò)硅膠柱色譜和制備高效液相色譜等現(xiàn)代分離手段對(duì)飛龍掌血提取物進(jìn)一步分離和純化， 將飛龍掌血中具有止血作用的有效成分提取、富集，并將制得的藥物應(yīng)用于制備止血的藥 劑。
[0007] 本發(fā)明一種活性香豆素單體的提取方法，是以飛龍掌血（TbWaJia asiaiica廣 A J Za?.)提取物為原料，先后經(jīng)硅膠柱色譜、制備高效液相色譜和重結(jié)晶等方法分離純化 而得到高純度茴芹香豆素單體化合物，其純度在98. 0%以上，單體化合物收率在80%以上。 藥效學(xué)研究表明該藥物具有良好的止血效果，止血效果與云南白藥相近。
[0008] 本發(fā)明所述的一種止血藥物的制備方法，是按下列步驟制備： (1) 將飛龍掌血（71〇〇^3^7<3<36^<3以1?(3( /2./)2(3^?.)的根或根皮洗凈、瞭干、粉碎過(guò)80 目篩； (2) 加入70%乙醇溶液（v/v)加熱回流提取3次，每次1小時(shí)，料液比均為I :3-8 ; (3) 將全部提取液合并，過(guò)濾，取濾液減壓蒸餾蒸去溶劑，得乙醇浸膏，向浸膏中加入 1-2倍重的40-60°C熱水，攪拌懸浮，得懸浮液； (4) 依次用0. 5-2倍體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取1-3次； (5) 分別減壓蒸餾蒸去溶劑，得石油醚萃取浸膏、氯仿萃取浸膏、乙酸乙酯萃取浸膏和 正丁醇萃取浸膏； (6) 將氯仿層浸膏轉(zhuǎn)移至AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱上； (7 )分別以水、10%、20%、、30%、40%、50%、60%、70%、80%和95%乙醇梯度洗脫，每個(gè)梯度洗 脫5-8個(gè)柱體積，取50%-70%乙醇洗脫液； (8) 將50%-70%乙醇洗脫液合并，采用噴霧干燥技術(shù)干燥后得到浸膏； (9) 將上述浸膏用200-300目柱層析用硅膠拌樣后，在低壓層析柱內(nèi)濕法上樣至硅 膠色譜柱，采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，洗脫比例分別為100:0,100:1，100:2,100:3， 100:5和100:7,收集石油醚-乙酸乙酯100:7梯度洗脫物，重結(jié)晶后得茴芹香豆素粗品； (10) 采用制備高效液相色譜法進(jìn)行純化，色譜柱固定相采用(：18或C s填料，流動(dòng)相為 0. 75%冰醋酸溶液（v/v)和甲醇的混合溶液，其配比為70:30,等度洗脫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 320nm，收集目標(biāo)組分，將所收集餾分減壓濃縮，丙酮重結(jié)晶后得到茴芹香豆素單體化合物。
[0009] 該化合物為淡黃色針細(xì)狀結(jié)晶，溶于氯仿，紫外燈254nm有暗斑，365nm有熒光， KOH乙醇溶液呈陽(yáng)性反應(yīng)，推測(cè)為香豆素類化合物。采用質(zhì)譜、核磁共振氫譜和碳譜等技 術(shù)對(duì)上述單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，ESI-MS餘々 269 [M+Na]+，247 D^Hh1H-NMR(CDCl3) δ (ppm) ：8.08(1H, d, ^9. 8 Hz, 6-H), 7. 66 (1H, d, J=2.2 Wz, 2-H), 7. 07 (1H, d, J=2.2 Hz, 3-H)，6.36(1? d，#9.8 Hz, 5-H)，4.04，4.15 (each 3H，s，0Me);13C-NMR (CDCl3) δ (ppm) : 160. 4 (C-2)，115. 5 (C-3)，139. 8 (C-4)，144. 4 (C-5)，134. 9 (C-6)，143. I (C-7)， 113.8(C-8)，149.7(C-9)，109.3(C-10)，145.4(C-2, )，104.1(C-3' )，61.1(C5-0Me)， 62. 2 (CS- OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)茴芹香豆素的數(shù)據(jù)一致，故確定該化合物為茴芹香豆素， 其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
上述純化步驟所用方法中，除可以采用制備液相色譜進(jìn)行純化外，還可以采用開(kāi)口 ODS柱色譜進(jìn)行精制，100-200目十八烷基硅烷健合硅膠反相ODS填料作為固定相，采用 0. 75%v/v冰醋酸溶液-甲醇進(jìn)行梯度洗脫。 本發(fā)明產(chǎn)品用三種不同溶劑系統(tǒng)，采用TLC法對(duì)單體化合物進(jìn)行薄層層析，然后分別 用紫外燈、10%硫酸-乙醇溶液和碘化鉍鉀試劑顯色，均為單一斑點(diǎn)。HPLC法進(jìn)行分析檢測(cè)， 采用峰面積歸一化法測(cè)定了單體中茴芹香豆素的純度，結(jié)果表明藥物中茴芹香豆素的純度 不低于98. 0%，茴芹香豆素的收率在80%以上。
[0010] 本發(fā)明一種止血藥物的應(yīng)用，是用于制備止血的藥物或制劑。
[0011] 上述所指的藥劑包括以茴芹香豆素為主藥，配以淀粉、糊精、羧甲基淀粉鈉、羧甲 基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、微晶纖維素、乳糖、滑石粉、硬脂酸鎂等常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝， 制成臨床可接受的劑型，如外用散劑、巴布劑，口服顆粒劑、膠囊劑、丸劑、注射劑和片劑等。
[0012] 本發(fā)明產(chǎn)品采用斷尾法測(cè)定小鼠出血時(shí)間，以小鼠給藥前后出血時(shí)間的縮短為指 標(biāo)，來(lái)判斷茴芹香豆素止血的效果。按體重分別□服灌胃給藥，每日灌胃一次，連續(xù)7天，于 第7天給藥30分鐘后采用毛細(xì)玻管法測(cè)定小鼠凝血時(shí)間CT，次日采用剪尾法測(cè)定出血時(shí)間 BT，以小鼠給藥前后凝血時(shí)間的縮短為指標(biāo)，來(lái)判斷止血藥的效果，結(jié)果表明本發(fā)明產(chǎn)品能 顯著縮短小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間，顯示了良好的止血活性，表明其可能對(duì)內(nèi)源性凝血 途徑有促進(jìn)作用。
[0013] 本發(fā)明提供從中藥飛龍掌血中提取、分離、純化茴芹香豆素的方法，收率達(dá)80%，純 度達(dá)98. 0%以上，藥理實(shí)驗(yàn)證明純茴芹香豆素有顯著的止血效果，止血活性，目前有關(guān)茴芹 香豆素單體止血活性的應(yīng)用尚屬空白。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1 :茴芹香豆素質(zhì)譜圖； 圖2 :茴芹香豆素核磁共振氫譜圖； 圖3 :茴芹香豆素核磁共振碳譜圖； 圖4 :茴芹香豆素氣相色譜圖和純度分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例一(茴芹香豆素單體的制備）： (1) 取飛龍掌血（71〇〇^3^7<3<36^<3以1?(3( /2./)2(3^?.)的根或根皮6.0公斤，洗凈、瞭干、 粉碎過(guò)80目篩； (2) 用10倍量（60L) 70% (v/v)乙醇回流提取3次，每次1小時(shí)； (3) 將全部提取液合并，過(guò)濾，取濾液減壓蒸餾蒸去溶劑，得乙醇浸膏1. 2公斤，向浸膏 中加入2. 4公斤60°C熱水，攪拌懸浮，得懸浮液； (4) 依次用2倍體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次； (5) 分別減壓蒸餾蒸去溶劑，得氯仿萃取浸膏281g、乙酸乙酯萃取浸膏46和正丁醇萃 取浸膏402g ; (6) 取氯仿層浸膏281g，轉(zhuǎn)移至AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱上； (7) 分別以水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 和 95% 乙醇以 l-3BV/h 的流速梯度 洗脫，每個(gè)梯度洗脫5-8個(gè)柱體積，取50%-70%乙醇洗脫液； (8) 將50%-70%