（3436cm1和1726cm % 13C NMR和DEPT譜共顯示32個碳信號，包括 七個甲基（一個含氧甲基），兩個亞甲基，十一個次甲基（五個烯烴碳，四個含氧碳），以 及十二個季碳（兩個含氧碳，四個羰基碳，三個烯烴碳）。 1H和13C NMR數(shù)據(jù)分析表明該 化合物含有一個典型的β取代呋喃環(huán)（SH7.25, br，s，lH;6. 16, br，s，lH和7.33, t， J = I. 7Hz ; δ C121. 3,140. 0,108. 6 和 143. 2)，一個酮羰基（δ C209. I)和三個酯羰基 (δ C175. 2,168. 4和165. 8)結(jié)構(gòu)。上述數(shù)據(jù)表明該化合物為檸檬苦素類化合物。HMBC譜 中，Η3-19(δΗ1·38, s)和 Η-30(δΗ3·27, s)與 C-1(SC209. 1)的相關(guān)性表明 C-I 為酮羰 基。兩個碳信號（S C78. 5, 2-C ;63· 5, 30-C)以及質(zhì)子信號（δ H3. 27, s，H-30)表明該化合 物含有一個30, 2-環(huán)氧基團。此外，C-3( δ C85. 3)位上連有一個巴豆酰氧基。HMBC譜中， !1-3'（5冊.89,9，了 = 7.1抱）和!1-3(5!14.82,8)與（：-1'（5(：165.8)的相關(guān)性驗證了上述 推論。腿8<：譜中，-0〇1 3(5!13.78,8)與(：-7(3(：175.2)，!1-6(3!14.18,8)與(：-5(3〇49.8) 和C-7( δ C175. 2)的相關(guān)性表明C-6( δ C68. 4)連有一個甲氧羰基片段。此外，6-0Η(3. 06， br，s)與 C-5 ( δ C49. 8)，C-6 ( δ C68. 4)和 C-7 ( δ C175. 2)的相關(guān)性表明 C-6 ( δ C68. 4)位 連有一個羥基。根據(jù) HMBC 譜中 Η-17(5·02, s)與 C-20〇C12L3)，C-21(5C140.0)和 C-22(SC108. 6)的相關(guān)性，可推斷呋喃環(huán)位于C-17〇C81.6)位上。綜合氫譜、碳譜、HMBC 譜和ROESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu) 型進一步通過E⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致（圖2)。
[0026] 實施例2 :化合物（I )藥理作用試驗
[0027] -、材料和儀器
[0028] HL7702肝細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所提供?；衔铮↖ )自制，方 法見實施例1，HPLC歸一化純度大于98 %。高糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM/F12 = 1:1培養(yǎng) 基、胎牛血清均購于HycLone。EDTA購于上海試劑一廠。臺盼藍購于北京化工廠。無糖DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco。胰酶、MTT、DMS0均購于Amresco。LDH釋放法檢測試劑盒購于GENMDE。 ALT生化檢測試劑盒、AST生化檢測試劑盒、LDH生化檢測試劑盒均購于美國貝克曼試劑有 限公司。Western及IP細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、MDA檢測試劑盒均購 于碧云天生物技術(shù)研究所。
[0029] CO2培養(yǎng)箱（SheL-Lab 2300)，電熱恒溫孵育箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）， 缺氧培養(yǎng)盒（長沙長錦科技有限公司），GasALert Extreme氧氣檢測儀（加拿大BW TechnoLogies)，酶標(biāo)儀（美國BioTek Epoch)，全自動生化儀（Beckman LX20)，離心機（德 國 Eppendorfcentrif μ ge5415D)，孔板離心機（德國 Eppendorfcentrif μ ge 5430R)，電子 微量天平（METTLER TOLEDO AL104)，PH 儀（Thermo ORION 3STAR) 〇
[0030] 二、試驗方法
[0031] 1、細(xì)胞分組
[0032] 將細(xì)胞分為6組，每組6個復(fù)孔：
[0033] (1)正常培養(yǎng)組（N組）：完全培養(yǎng)基，正常條件下培養(yǎng)；
[0034] (2)缺血再灌注組（IR組）：完全培養(yǎng)基正常條件培養(yǎng)Ih后，模擬缺氧8h，再灌注 4h ；
[0035] (3)化合物（I )組：
[0036] REl 組：化合物（I ) 0· 5ng/mL 預(yù)處理 Ih ;
[0037] RE2 組：化合物（I ) 5ng/mL 預(yù)處理 Ih ;
[0038] RE3組：化合物（I ) 50ng/mL預(yù)處理Ih ;模擬缺氧8h，再灌注4h ;
[0039] (4)生理鹽水組（NS組）：以與化合物（I )同等體積的生理鹽水預(yù)處理lh，模擬 缺氧8h，再灌注4h。
[0040] 2、化合物（I )的預(yù)處理
[0041] (1)化合物（I )的配制：將Img化合物（I )溶解于500mL生理鹽水中。移液槍 吸取2. 5mL于第一支離心管中，用生理鹽水稀釋至IOmL配制成濃度為500ng/mL的化合物 (I )溶液。從第一支離心管中吸取ImL至第二支離心管中，用生理鹽水稀釋至IOmL配制 成濃度為50ng/mL的化合物（I )溶液。從第二支離心管中吸取ImL至第三支離心管中， 用生理鹽水稀釋至IOmL配制成濃度為5ng/mL的化合物（I )溶液。作好標(biāo)記。
[0042] (2)化合物（I )預(yù)處理：正常培養(yǎng)組和缺血再灌注組以每孔100 μ L新鮮的完 全培養(yǎng)基更換。REl組每孔加入5ng/mL的化合物（I )溶液10 μ L和新鮮的完全培養(yǎng)基 90 μ L，RE2組每孔加入50ng/mL的化合物（I )溶液10 μ L和新鮮的完全培養(yǎng)基90 μ L， RE3組每孔加入 500ng/mL的化合物（I)溶液10μL和新鮮的完全培養(yǎng)基90μL。生理鹽 水組每孔加入生理鹽水10 μ L和新鮮的完全培養(yǎng)基90 μ L。輕輕搖動96孔板，使藥液充分 混混勻，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育lh。
[0043] 3、肝細(xì)胞體外模擬缺血再灌注損傷模型的建立：
[0044] (1)體外模擬缺血過程：預(yù)處理時間結(jié)束后，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出第一塊96孔板， 正常培養(yǎng)組每孔用100 μ L完全培養(yǎng)基更換，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h。從CO2培養(yǎng)箱 中取出第二塊96孔板，缺血再灌注組、化合物（I )預(yù)處理組和生理鹽水組每孔用IOOyL 無糖DMEM培養(yǎng)基置換完全培養(yǎng)基，放入缺氧培養(yǎng)盒中，培養(yǎng)盒中放入盛有50mL滅菌水的 無菌小瓶保持飽和濕度。將缺氧培養(yǎng)盒放入37°C恒溫孵育箱中，進氣口連接94% N2-5 % CO2-I % (V混合氣體，出氣口連接氧氣檢測儀。以2L/min的氣體流量通入混合氣體，當(dāng)氧 氣檢測儀顯示出氣口氧氣濃度〈1 %時，調(diào)節(jié)混合氣體流量300mL/min維持出氣口氧氣濃度 〈1%。以此模擬缺血過程8h。
[0045] (2)體外模擬再灌注過程：從CO2培養(yǎng)箱中取出第一塊96孔板，正常培養(yǎng)組每孔更 換100 μ L新鮮的完全培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。從缺氧培養(yǎng)盒中取出第二塊 96孔板，缺血再灌注組、化合物（I )預(yù)處理組和生理鹽水組每孔用100 μ L新鮮的完全培 養(yǎng)基置換無糖DMEM培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱中正常條件下（37°C、5% C02、95%空氣、飽和濕 度）培養(yǎng)4h，模擬再灌注過程。
[0046] 3、指標(biāo)檢測
[0047] 3. IMTT法檢測肝細(xì)胞活力
[0048] (I) MTT溶液配制：用電子微量天平稱取250mg MTT，放入小燒杯中，加入50mL PBS 攪拌30min，使之充分溶解，即為濃度為5mg/mL的MTT溶液。在超凈工作臺中用0. 22 μ m的 微孔濾器除菌，分裝為每支lmL，4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0049] (2)細(xì)胞準(zhǔn)備：按上述方法進行細(xì)胞分組，并另設(shè)調(diào)零孔。并按上述方法進行化合 物（I )預(yù)處理和體外模擬缺血再灌注過程。
[0050] (3)呈色：終末時間點每孔加入5mg/mL的MTT溶液20yL，放入37°C、5%C02、95% 空氣、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入 100 μ L DMSO溶液，微量振蕩器上振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。
[0051] (4)比色：選擇570nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收度⑷，記錄結(jié)果。實驗重 復(fù)2次。
[0052] 3. 2乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞繁殖與毒性檢測
[0053] 按GENMED乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒說明書操作，重復(fù)2 次。
[0054] (1)按上述方法準(zhǔn)備待測細(xì)胞，并另設(shè)無細(xì)胞的培養(yǎng)液（背景空對照孔）和未處理 的后續(xù)裂解的細(xì)胞（樣品最大酶活性對照孔），作好標(biāo)記。
[0055] (2)到規(guī)定的檢測時間點前1小時，從CO2培養(yǎng)箱中取出待測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 加入10 μ L GENMED裂解液到未處理的后續(xù)裂解的細(xì)胞孔里，同時加入10 μ L GENMED補充 液到其余所有檢測孔里。放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1小時即規(guī)定檢測時間。
[0056] (3)從0)2培養(yǎng)箱取出待測96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入孔板離心機離心10min，速度為 250g〇
[0057] (4)分別小心移