一種與長(zhǎng)QT綜合征相關(guān)的miRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)一種可預(yù)判長(zhǎng)QT綜合征罹患風(fēng)險(xiǎn)及診斷的miRNA，即miR-3619， 及其反義寡聚核苷酸AM0-3619在制備治療長(zhǎng)QT綜合征藥物中的應(yīng)用，確切地說(shuō)，本發(fā)明涉 及AM0-3619在制備治療長(zhǎng)QT綜合征藥物中促進(jìn)hERG基因功能的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)QT綜合征（Long QT Syndrome，LQTs)是指是指心電圖上QT間期延長(zhǎng)、T波異 常，易產(chǎn)生室性心律失常，尤其是尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過(guò)速（Torsade de points，TdP)、暈 厥和猝死的一組綜合征。按照病因，可分為先天性長(zhǎng)QT綜合征（cLQTs)和獲得性長(zhǎng)QT綜合 征（aLQTs)。cLQTs是兒童和年輕人發(fā)作性暈厥和意外猝死的主要原因。多種通道基因突 變可導(dǎo)致先天性長(zhǎng)QT綜合征，目前已發(fā)現(xiàn)有13個(gè)基因突變與先天性長(zhǎng)QT綜合征相關(guān)，但 hERG基因突變致鉀通道功能缺陷所致的先天性2型長(zhǎng)QT綜合征更常見，占總突變的45%， 為第二常見突變基因。目前已發(fā)現(xiàn)300多個(gè)hERG基因突變位點(diǎn)與先天性長(zhǎng)QT綜合征相關(guān)。 而在臨床工作中，獲得性長(zhǎng)QT綜合征更常見，其和TdP的發(fā)病密切關(guān)聯(lián)，具有潛在致命性， 是院內(nèi)心臟性猝死的重要原因之一。目前已知有多種因素與獲得性長(zhǎng)QT綜合征相關(guān)，包括 藥物、心動(dòng)過(guò)緩/速、冠心?。ㄐ募∪毖?、心肌梗死）、心肌肥厚、心力衰竭和遺傳易感性等， 其中藥物導(dǎo)致的獲得性長(zhǎng)QT綜合征影響最廣。
[0003] HERG (huamn ether-a-Go-Go related gene，hERG)基因，即 KCNH2,定位于人 7 號(hào) 染色體。研究表明hERG基因編碼的快速激活延遲整流鉀電流（IKr)在正常的動(dòng)作電位復(fù) 極過(guò)程中起關(guān)鍵作用。它是多種藥物產(chǎn)生心臟不良反應(yīng)的分子靶標(biāo)，與QT間期延長(zhǎng)最為緊 密相關(guān)。藥物本身或其代謝產(chǎn)物阻滯Ikr、延長(zhǎng)心臟復(fù)極化是藥物獲得性長(zhǎng)QT綜合征的重 要分子機(jī)制之一。美國(guó)食品和藥品管理局（FDA)規(guī)定所有藥物上市前必須進(jìn)行HERG的安 全性評(píng)價(jià)。研究表明，先天性和獲得性因素均可以通過(guò)hERG通道合成障礙、轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、門控 及通透性改變最終導(dǎo)致長(zhǎng)QT綜合征的發(fā)生。因此，更好的理解hERG相關(guān)LQTS的發(fā)病機(jī)制 將有助于針對(duì)LQTS病人尋找新的治療手段。
[0004] 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)約21~25nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過(guò) 與靶基因 mRNA互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，抑制蛋白質(zhì)的翻譯或促進(jìn)mRNA 降解，從而對(duì)靶基因的表達(dá)起著反向調(diào)節(jié)作用。部分miRNA在心血管組織中特異性表達(dá)，使 其在心血管系統(tǒng)發(fā)育及心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，一系列研究證實(shí)， miRNA過(guò)度上調(diào)或下調(diào)均可引起離子通道蛋白表達(dá)紊亂，致離子通道平衡失調(diào)，誘發(fā)心律 失常，是潛在的心律失常作用靶點(diǎn)。例如，miR-1可作用于縫隙連接通道蛋白43及內(nèi)向整 流鉀通道的α亞單位從而降低心臟功能及引起缺血性心律失常；在糖尿病心臟病兔模型 miR-133的高表達(dá)可抑制hERG基因表達(dá)從而導(dǎo)致心律失常的發(fā)生；在乳鼠心肌細(xì)胞證實(shí)， 藥物三氧化二砷可通過(guò)上調(diào)miR-21和miR-23a的水平抑制hERG蛋白表達(dá)從而導(dǎo)致長(zhǎng)QT 綜合征。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予相應(yīng)miRNA互補(bǔ)的反義寡聚核苷酸序列（anti-miRNA oligonucleotides，AMOs) (AMO-1、AMO-133、AMO-21、AM0-23a)可以減少相應(yīng)的心律失常發(fā) 生。因此臨床上可將miRNA作為診斷標(biāo)記物及潛在治療靶標(biāo)，而運(yùn)用與miRNA互補(bǔ)的寡核 苷酸序列AMOs可抑制相應(yīng)miRNA的功能，表明AMOs在作為心律失常的治療手段方面具有 重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 目前長(zhǎng)QT綜合征的治療主要采取藥物治療、左心交感神經(jīng)去除術(shù)和植入心臟復(fù) 律除顫器，但這些方法均存在局限性，而且不能根治。因此尋找有效的治療手段，具有重要 的臨床意義。而于遺傳性長(zhǎng)QT綜合征，采取基因治療是根治的方法之一。而現(xiàn)有技術(shù)中， 尚未發(fā)現(xiàn)促進(jìn)hERG基因功能的治療長(zhǎng)QT綜合征的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] miRNA和靶基因的關(guān)系是"多對(duì)多"的，一個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，同樣，一 個(gè)靶基因也可以有眾多的miRNA。我們以miRNA和HERG基因的關(guān)系為切入點(diǎn)，以HERG為 革巴基因反向篩選驗(yàn)證與其相關(guān)的miRNA。通過(guò)聯(lián)合多個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站RegRNA、miRanda、 TargetScan 綜合預(yù)測(cè)出與 HERG 相關(guān)的 6 個(gè) miRNA :miR-3619、miR-134、miR-143、miR-103、 miR-147、miR-185。首先選定miR-3619,應(yīng)用雙螢光素酶基因報(bào)告法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) miR-3619可與hERG結(jié)合，提示hERG是它的靶基因。同時(shí)，在穩(wěn)定表達(dá)的hERG-HEK293細(xì)胞 中，RT-PCR和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-3619對(duì)hERG mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)呈負(fù)調(diào)控， 其特異性的反義寡聚（脫氧）核苷酸（AM0-3619)可以拮抗miRNA的作用；激光共聚焦顯示 miR-3619同時(shí)降低了細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)hERG蛋白的表達(dá)，AM0-3619亦可拮抗這種作用；這些 實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相符合，均驗(yàn)證了 miR-3619對(duì)hERG基因的負(fù)性調(diào)控作用，同時(shí)證明AM0-3619 可通過(guò)增加通道蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)hERG基因功能，改善長(zhǎng)QT綜合征，從而完成了本發(fā) 明。而已有諸多研究證實(shí)HERG功能抑制是先天性和獲得性長(zhǎng)QT綜合征重要的發(fā)病機(jī)制之 一，故miRNA-3619可作為診斷長(zhǎng)QT綜合征的分子標(biāo)記物及潛在治療靶點(diǎn)，而AM0-3619用 于制備治療長(zhǎng)QT綜合征藥物也具有明顯的創(chuàng)新性和切實(shí)的可行性。
[0007] 長(zhǎng)QT綜合征的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已有研究證實(shí)hERG功能改變是LQTs重要的發(fā)病機(jī) 制之一，且我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-3619表達(dá)的上調(diào)可減低hERG蛋白表達(dá)、抑制hERG基因功 能，然而miRNA在長(zhǎng)QT綜合征的具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究和探討。鑒于目前尚無(wú)有 效防治長(zhǎng)QT綜合征的方法，將相關(guān)miRNA作為其分子診斷標(biāo)記物和潛在治療靶點(diǎn)以及將相 應(yīng)AMOs用于治療長(zhǎng)QT綜合征藥物制備的應(yīng)用具有相當(dāng)?shù)钠惹行?。?dāng)然，我們需要在動(dòng)物 或人心肌細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證miR-3619對(duì)hERG基因的調(diào)控作用。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 材料與方法
[0009] 1. 1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
[0010] 1. 1. 1主要實(shí)驗(yàn)儀器
[0011] 表1實(shí)驗(yàn)儀器名稱和生產(chǎn)廠家
[0012]
[0014] I. I. 2實(shí)驗(yàn)藥品和試劑
[0015] 表2實(shí)驗(yàn)藥品名稱和生產(chǎn)廠家
[0016]
[0018] I. I. 3實(shí)驗(yàn)方法
[0019] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
[0020] 用Trizol試劑從已轉(zhuǎn)染的U20S細(xì)胞中提取總RNA。將RNA隨后用無(wú)菌的 Rnase-free處理，hERG基因 mRNA的水平使用Taqman探針評(píng)估與qRT-PCR檢測(cè)。引物和探 針是來(lái)自ABI公司cat. #4331182(編號(hào)：Hs04234270-gl)。反轉(zhuǎn)錄條件設(shè)定為初始步驟在 95°C 10分鐘，隨后在95°C 15秒40個(gè)循環(huán)，并在60°C下維持1分鐘。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)獨(dú)立重 復(fù)進(jìn)行三次。結(jié)果用2-△△ CT相對(duì)定量方法分析30。
[0021] Western blot
[0022] 提取hERG蛋白的步驟免疫印跡分析按先前描述的。簡(jiǎn)而言之，首先轉(zhuǎn)染 pcDNA-hERG到U20S細(xì)胞中。所表達(dá)的hERG細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)染各自的miRNA或miRNA加上 相應(yīng)的AMOs。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲細(xì)胞。將等量的蛋白灌注在已制備好的7. 5% SDS聚丙 烯酰胺凝膠上，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜封閉用5%的脫脂奶粉，接著用兔多克隆抗 hERG的抗體在4°C下孵育過(guò)夜。在TBST中將膜洗滌三次，然后在室溫下用山羊抗兔IgG孵 育1小時(shí)。印跡處理用SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物（Pierce Biotechnology公 司，美國(guó)），并使用Syngene公司的成像系統(tǒng)。
[0023] 實(shí)驗(yàn)表明，我們采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)反向篩選聯(lián)合雙熒光素酶報(bào)告基因、 qRT-PCR、Western blot、激光共聚焦技術(shù)篩選出了 miR-3619可以負(fù)性調(diào)控hERG蛋白表達(dá)， 相應(yīng)的AM0-3619可以沉默miR-3619對(duì)hERG的抑制作用。我們的實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步理解hERG 蛋白的調(diào)控機(jī)制及從基因角度對(duì)長(zhǎng)QT綜合征進(jìn)行治療提供了新的視角。然而，這些研究結(jié) 果需要在動(dòng)物模型、前期臨床及臨床中進(jìn)一步驗(yàn)證。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. miRNA-3619在作為預(yù)判患長(zhǎng)QT綜合征風(fēng)險(xiǎn)和診斷長(zhǎng)QT綜合征分子標(biāo)記物中的應(yīng) 用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-3619是成熟miR-3619。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述長(zhǎng)QT綜合征選自先天性長(zhǎng)QT綜合征2型， 獲得性長(zhǎng)QT綜合征的一種或多種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述長(zhǎng)QT綜合征可能引起尖端扭轉(zhuǎn)性室 性心動(dòng)過(guò)速。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述長(zhǎng)QT綜合征可能引起心臟形猝死。 6. AM0-3619在制備治療長(zhǎng)QT綜合征藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物組合物中含有AM0-3619。8. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述AM0-3619為miR-3619的反義寡 核苷酸序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述的應(yīng)用，其特征在于，AM0-3619為miR-3619抑制劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可作為長(zhǎng)QT綜合征預(yù)判罹患風(fēng)險(xiǎn)和診斷的分子標(biāo)記物，即miRNA-3619；以及其反義寡聚核苷酸AMO-3619在制備治療長(zhǎng)QT綜合征藥物中的應(yīng)用，主要在于藥物促進(jìn)hERG基因功能的應(yīng)用，其特征在于，藥物組合物含有AMO-3619。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/113, A61K48/00, A61P9/06, A61K31/7105
【公開號(hào)】CN105385688
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510764308
【發(fā)明人】鄭梅霞, 廉姜芳, 周建慶, 楊曦, 黃曉燕, 莊凱麗, 國(guó)建, 毛海燕, 巴艷娜, 方培亮
【申請(qǐng)人】寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院
【公開日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年11月5日