一種人表皮生長因子的制備方法及增加人表皮生長因子復溶性的藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說用超濾濃縮方法，將原尿濃縮10倍以上。然后利用等電點法及飽和硫酸銨，沉淀出尿中蛋白的一種制備人表皮生長因子的方法研究。
【背景技術】
[0002]表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)是最早發(fā)現(xiàn)的生長因子，對調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和分化起著重要作用。在人類，表皮生長因子蛋白有53個氨基酸殘基，三個二硫鍵，質量6千道耳頓。
[0003]在人體中，表皮生長因子是由53個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，多肽中沒有丙氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。它有三個二硫鍵，這些二硫鍵是它具有生物活性所必需的，如加入琉基試劑和尿素，則表皮生長因子失活，肽鏈上的巰基可在空氣中自然氧化而完全恢復活性。
[0004]表皮生長因子是人體內(nèi)分泌的一種重要的生長因子，極微量即能強烈促進皮膚細胞的分裂和生長，此外，它還能刺激細胞外一些大分子(如透明質酸和糖蛋自等)的合成和分泌，滋潤皮膚，因此它既可作為化妝品的添加劑及用于面部整形手術，促進人皮膚的新陳代謝、減少皮膚畸形；也可在醫(yī)藥上治療皮膚外傷、術后創(chuàng)口、褥瘡、口腔潰瘍和壞疽、以及放射治療引起的皮炎等。它可以加速傷口和潰瘍面的愈合。
[0005]人表皮生長因子廣泛存在人體多種組織，具有促進角化細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞等細胞的生長作用。對內(nèi)皮細胞和成纖維細胞有趨化刺激作用，使其迀移向受損部位，還可促進成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白，在創(chuàng)傷修復中有一定的作用，但因組織中表皮生長因子的含量普遍較低，即使所有積累在創(chuàng)面的內(nèi)源性表皮生長因子均能與受體結合，其分子環(huán)境中的表皮生長因子仍達不到最適水平，難以滿足細胞增殖和肉芽組織發(fā)育的最大需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目是提供了一種精制表皮生長因子的方法。
[0007]本發(fā)明采用以下工藝方案予以實現(xiàn)上述目的:
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚，12h內(nèi)處理。
[0008](1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)ρΗ8.2?8.8，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH6.2-6.8值，靜置0.5h，將上清液進行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH4.2-4.8值，最后放于4°C的環(huán)境中過夜。
[0009](2)蛋白質等電點沉淀工序:上清液加(順4)#04至飽和，4 °C靜置25~35h，離心后沉淀。
[0010](3)梯度洗脫工藝:陰離子交換柱用洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120~130ml/min左右；用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130ml/min,得洗脫液；將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液。
[0011](4)沉淀工藝:超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0012](5)凍干:將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得表皮生長因子。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，而不以任何方式限制。
[0014]實施例1
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚，12h內(nèi)處理。
[0015]1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)ρΗ8.5，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH6.5值，靜置0.5h，將上清液進行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH4.5值，最后放于4°C的環(huán)境中過夜。
[0016]2)蛋白質等電點沉淀工序:上清液加(見14)2504至飽和，4°C靜置30h，離心后沉淀。
[0017]3)梯度洗脫法工序(以0.25L柱體為例)
3.1)稱取表皮生長因子粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
3.2)陰離子交換柱用2.5L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120ml/min左右；
3.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120ml/min，得洗脫液；
3.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0018]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0019]5)凍干
將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得表皮生長因子。
[0020]實施例2
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚，12h內(nèi)處理。
[0021 ] 1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)ρΗ8.2，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH6.2值，靜置0.5h，將上清液進行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH4.2值，最后放于4°C的環(huán)境中過夜。
[0022]2)蛋白質等電點沉淀工序:上清液加(順4)#04至飽和，4 °C靜置25h，離心后沉淀。
[0023]3)梯度洗脫法工序(以0.25L柱體為例)
3.1)稱取表皮生長因子粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
3.2)陰離子交換柱用3.0L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在130ml/min左右；
3.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130ml/min，得洗脫液； 3.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0024]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0025]5)凍干
將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得表皮生長因子。
[0026]實施例3
取實施例2中制備的表皮生長因子200萬單位，稱取20g甘露醇，量取200ml甘油、丙二醇10ml、三乙胺5ml，加500ml注射用水溶解，混合后用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)Ph值至6.5，然后加注射用水至1000ml，聚醚砜超濾膜無菌過濾，分裝于1000個已處理好的西林瓶中，凍干、乳蓋即可。
[0027]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。
【主權項】
1.一種人表皮生長因子的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)超濾濃縮工序:取10L尿液，用50%Na0H調(diào)pH，靜置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值，靜置0.5h，將上清液進行超濾濃縮至2L，之后再用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值，最后放于4°C的環(huán)境中過夜； (2)蛋白質等電點沉淀工序:上清液加(見14)2504至飽和，4°C靜置，離心后沉淀； (3)梯度洗脫工藝:用洗脫液A溶解沉淀，攪拌、離心，留取離心液；用洗脫液B平衡陰離子交換柱，將上述離心液上柱；用洗脫液B溶液洗脫柱子；收集洗脫液；洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾，得超濾液； (4)沉淀 超濾液中加入乙醇沉淀，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物； (5)凍干 將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得表皮生長因子。2.根據(jù)權利要求1所述的人表面生長因子的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，用50%Na0H溶液調(diào)溶液的PH值為8?9，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值為6?7，之后再次用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值為4?5。3.根據(jù)權利要求1所述的人表面生長因子的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，4°C靜置24?36 ho4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)其中洗脫液A可選用0.01-0.3mol/L醋酸鹽緩沖液，在PH值4.0-9.0的條件下洗脫。5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)其中洗脫液B可選用0.01-0.5mol/L 醋酸鈉 +0.l~5mol/L NaCl，在 PH 值 3.0-8.0 的條件下洗脫。6.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)其中洗脫液D可選用0.01-0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，在PH值3.0-8.0的條件下洗脫。7.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其中選用的陰離子交換柱包括:強陰離子交換柱Q-Sephadex A-25, Q-S印hadex A-50, Q-Sephadex C-25, Q-Sephadex C-50;弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-CelluloseDE-52，DEAE-Cellulose DE-53。8.根據(jù)權利要求1~7所述制備的人表皮生長因子，其特征在于:凍干后得到的蛋白質0.61mg，充分證明了人尿是人表皮生長因子的一個可用來源。9.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權利要求1-8制備的人表皮生長因子作為活性成分，還含有甘油、甘露醇、丙二醇、三乙胺。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備人表皮生長因子的工藝的方法研究。具體的說，就是以健康成年男性新鮮尿液為原料，經(jīng)過超濾、等電點沉淀以及梯度洗脫法等現(xiàn)代蛋白質高端生化分離技術來制備人表皮生長因子，可以從10L尿液中，得到初步電泳純的人表皮生長因子0.61mg。
【IPC分類】A61K38/18, C07K1/34, A61K9/19, C07K1/30, A61P17/02, C07K14/485, C07K1/18, C07K1/36
【公開號】CN105399810
【申請?zhí)枴緾N201510806666
【發(fā)明人】劉乃山, 林曉磊, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年11月21日